益腎清絡活血方對CFA大鼠OPG/RANKL通路的影響及機制

李丹鳳，王 雯，許 萍，陳修平，李 艷

(1.皖南醫學院研究生學院，2.皖南醫學院弋磯山醫院中醫科，國醫大師李濟仁工作室，安徽 蕪湖 241002)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明以滑膜炎癥增生、軟骨破壞等為特征的自身免疫性疾病，致機體出現不可逆的關節損傷，甚至殘疾，嚴重影響身心及社會健康[1-2]。目前，現代醫學對于RA患者的治療重點多是免疫抑制加非甾體類消炎藥和抗風濕藥，長期服用有一定的副作用[3]。因此，迫切需要開發一種治療RA的藥物用于臨床。新安醫家李艷主任在李濟仁教授清絡飲(Qing-luo-yin,QLY)基礎上，自擬益腎清絡活血方(Yisheng-Qingluo-Huoxie prescription,YSF)，臨床療效明顯，但相關機制尚未明確。

據很多文獻報道RA的機制，多由于炎癥、免疫的失調以及骨侵蝕破壞[4-7]，同時，滑膜炎是關節骨侵蝕的主要原因，與一些維持破骨細胞穩態的調節因子缺乏控制密切相關，如核因子受體激活因子B配體(nuclear factor receptor activator B ligand,RANKL)水平升高和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)下降。因此，目前RA治療的主要目的是降低免疫炎癥反應，抑制關節惡病變和骨損傷的發展，進而保護關節功能。故本研究旨在以AIA模型為基礎，初步研究新安YSF方是否在抑制炎癥反應及骨保護方面發揮作用。

1 材料與方法

1.1 動物雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量(200±20) g，6周齡，共32只，購自南京青龍山實驗動物公司，生產許可證：SCXK(上海)，2018-0004。本研究經過皖南醫學院實驗動物倫理委員會批準，在SPF動物房適應性喂養7 d后，用于實驗研究。

1.2 藥品與試劑QLY成份：苦參、黃柏、黃柏各9 g、萆薢10 g；YSF成份：QLY加炙黃芪30 g、當歸15 g、炒菟絲子12 g、仙靈脾12 g、雞血藤15 g、紅藤15 g、法半夏9 g、蒲公英20 g，按照古方與現代劑量的換算倍數計算，大鼠每日灌胃YSF與QLY劑量換算成生藥量分別為14.863、9.87 g·kg-1，中藥材購于皖南醫學院弋磯山醫院中藥房；完全弗氏佐劑(CFA)與芽孢桿菌Calmette-Guérin (BCG)購于Rebio Scientific(中國上海)和Rebio Scientific(美國雷德蒙德)。ELISA ：TNF-α、IL-1β(杭州聯科生物，批號為：A382H01112、A301BH00752)、OPG、RANKL(Biotech，批號：EIA-3509、EIA-3390)；OPG、RANKL、β-actin抗體(ABclonal，貨號分別為：A10551、A2550、AC038)；二抗Anti-Rabbit IgG(Thermo，貨號為：C31460100)；BCA增強型試劑盒(Beyotime，貨號P10010)；化學發光檢測試劑盒(USA，貨號P90719)；SDS-PAGE蛋白染色機上樣緩沖液(Beyotime，貨號P0281S)；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(通用型，50X)(Beyotime，貨號：P1045)、RIPA裂解液(Beyotime，貨號：P0013B)；TBS緩沖液(biosharp，貨號BL602A)；ReverAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermoscientific，貨號01049288)和Universal qPCR Master Mix(BioLabs，貨號10086870)。

1.3 儀器RE52CS型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；LC-SFJ-10手持式勻漿機(上海力辰西儀器科技有限公司)；Anthos Zenyth 200 型全波長酶標儀(英國 Biochrom 公司)；PCR儀(美國ABI 7500 Real Time PCR System，Applied Biosystems)；核酸蛋白測定儀(美國ABI Qubit 熒光定量)；SimpliAmp PCR儀；EG1150H組織包埋機、RM2245轉輪式切片機、HI1210攤片機、HI1210烤片機、AutoStainerXL(ST5010)自動載玻片染色機均購于Leica，德國；BX54光學顯微鏡、DP27成像系統均購于Olympus，日本；PowerPac Bsic型電泳儀、Mini Subcell GT型水平電泳槽(美國Life Technologies公司)；AlphaImager HP凝膠成像系統(美國ProteinSimpie 公司)；DV215CD型精密電子天平(美國Ohaus公司)。

1.4 方法

1.4.1模型制備 在SPF動物房隔離室適應性喂養7 d后，制備模型：75%乙醇消毒大鼠左足后跖部，皮下注射CFA 0.1 mL，誘導AIA模型大鼠，隨機取8只為Normal組大鼠，以生理鹽水代替CFA，剩余大鼠全部予以CFA注射。其中CFA的制備，參照文獻[8]。

1.4.2分組及給藥 按照隨機數字法，取8只作為Normal組，剩余造模成功的分為：AIA組，AIA-YSF組和AIA-QLY組，每組各8只，造模首日起，YSF組和QLY組分別給予14.863、0.987 g·kg-1·d灌胃量；剩余Normal與AIA全部予以等劑量生理鹽水。

1.4.3大鼠關節炎評分及體質量的評估 關節炎評分由兩位獨立的研究人員量化，根據每只爪子的炎癥表現，評分為1～4分[9]，同時稱體質量，并觀察其一般臨床情況。

1.4.4HE染色法觀察大鼠組織關節的病理變化 取大鼠右后肢膝關節與踝關節，置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h以上，經過修塊、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、撈片、烤片，從染色機中取出，中性樹膠封片，最后于正置顯微鏡下觀察關節組織病理變化。

1.4.5IHC檢測大鼠關節中p-p65、MMP3的表達 取大鼠右后肢關節的石蠟切片，通過IHC進行定位評價，并與抗體p-p65、MMP3孵育在4 ℃，按制造商的說明，用二氨基聯苯胺四鹽酸鹽進行顯色反應，胞核蘇木精反染，置顯微鏡下觀察關節組織病理變化。

1.4.6Q-PCR分析 用TRIzol試劑裂解滑膜組織。氯仿萃取后，有機相被丟棄。將水中總mRNA用異丙醇沉淀，再用75%乙醇純化，在SimpliAmp上作為cDNA合成的模板熱循環器(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)。獲得的cDNA隨后使用7500 Real-Time PCR系統進行qPCR分析。以β-acin為內參，根據2-△△CT法計算檢測基因的相對表達量。引物序列詳細如下：β-actin，F：5′-TGTCCAC CTTCCAGCAGATGT-3′，R：5′-AGCTCAGTAACAGTC CGCCTAGA;OPG-3′，F：5′-CCTTGCCCTGACCACTCT TAT-3′，R：′-CACACACTCGGTTGTGGGT-3′;RANKL，F：5′-GCAGATTTGCAGGACTCGACT-3′;R：5′-CCCC ACAATGTGTTGCAGTT-3′;MMP3，F：5′-GACACCAG CATGAACCTTGTT-3′;R：5′-GGAACCGAGTCAGGAC TATG-3′;TIMP-1，F：5′-CCTTCTGCAATTCCGACCT CGTC-3′;R：5′-CGGGCAGGATTCAGGCTATCTGG-3′。

1.4.7ELISA分析TNF-α、IL-1β、OPG、RANKL的表達 動物麻醉后，促凝管予以腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 500 r·min-1，離心10 min，根據試劑盒說明書，檢測血清中各指標的定量表達。

1.4.8Western blot檢測大鼠滑膜中OPG與RANKL蛋白表達 取大鼠雙后肢的滑膜組織，將其剪成小塊，加入蛋白酶抑制劑(100X)、磷酸酶抑制劑(50X)、蛋白裂解液(RIPA)一定比例的混合液，冰上裂解，于4 ℃、12 000 r·min-1、離心10 min，取上清，BCA試劑盒，定量蛋白質含量，SDS稀釋緩沖液稀釋后的樣品沸水變性，分等份，-80 ℃下保存。配制10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，上樣、電泳、轉膜、封閉、洗滌、顯影，最后用ImageJ軟件分析其灰度值。

2 結果

2.1 大鼠體質量、關節炎癥評分的變化如Tab 1所示，自繼發性炎癥d 15開始，YSF組的AIA大鼠關節炎評分明顯低于AIA模型大鼠，且體質量未見明顯下降(P<0.05，P<0.05)，觀察期結束時，關節炎癥趨于緩和，體質量未見明顯異常。

2.2 關節病理Normal組大鼠踝關節未出現異常病理變化。AIA組較Normal組出現明顯的滑膜浸潤、軟骨破壞以及骨侵蝕。經YSF與QLY治療后，大鼠關節滑膜腔相對比較完整。但Fig 1示YSF較QLY在滑膜浸潤方面療效明顯。

2.3 YSF經免疫組化法在大鼠關節中p-p65及MMP3的表達Fig 2、3示，p-p65以及MMP3在大鼠關節部位的陽性表達，與Normal組比較，AIA組陽性表達最明顯；QLY次之，YSF與Normal最為接近。

Tab 1 Effect of YSF on weight and arthritis scores and of RA model

Fig 1 Effect of YSF on histopathological changes of rat ankle joints (HE，400×)

Fig 2 Effect of YSF on p-p65 in rat ankle tissues (IHC，400×)

Fig 3 Effect of YSF on MMP3 in rat ankle tissues (IHC，400×)

2.4 RT-PCR檢測滑膜中RANKL、OPG mRNA的表達結果Tab 2所示，與Normal組比，AIA組大鼠明顯升高滑膜組織中RANKL的mRNA表達水平，(P<0.05)，降低OPG的mRNA表達(P<0.05)。其中YSF下調了滑膜中RANKL的表達(P<0.01)，上調了OPG的mRNA的表達(P<0.01)。

Tab 2 mRNA expression of RANKL and

2.5 ELISA分析TNF-α、IL-1β、RANKL、OPG、OPG/RANKL的表達如Tab 3所示，與Normal組相比，血清中TNF-α、IL-1β和RANKL水平在AIA模型中明顯升高(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，OPG、OPG/RANKL則明顯下降(P<0.01，P<0.01)，而YSF明顯抑制其炎癥指標的升高，升高OPG及OPG/RANKL水平(P<0.01，P<0.01)。

2.6 Western blot檢測大鼠滑膜中OPG與RANKL蛋白的表達Fig 4示，與Normal組比，AIA組大鼠滑膜中OPG表達量明顯降低(P<0.01)，RANKL的蛋白表達則升高(P<0.05)；經YSF治療后，OPG明顯高表達(P<0.05)，而RANKL則明顯低表達(P<0.01)，遺憾的是，QLY的滑膜蛋白表達未見明顯的統計學差異。

3 討論

傳統中醫中藥配方，依據“君臣佐使”理論可以通過增效、減毒來改善RA的臨床癥狀。QLY是新安流派“張一貼”第14代傳人李濟仁教授療痹病的經典名方，以苦參、黃柏、萆薢、青風藤為核心藥，尤善治療熱痹。前期課題組經過了大量的實驗研究，發現其具有有效性、相對安全性和成本-效果等優勢[10-11]，故選擇其為陽性對照藥，而不是一貫以臨床常用甲氨蝶呤、來氟米特等為對照，此舉亦是在祖國中醫藥被大力弘揚的背景下，選取中藥有效方劑為對照。隨著疾病的進展，RA患者后期多出現肝腎虧虛、經絡受阻之象，僅靠單純的清熱除痹、通絡止痛之法，療效尚未達到理想預期。為此，國醫大師李濟仁教授嫡系傳人李艷主任在“痿痹統一論”思想指導下，基于益腎固本、氣血雙補的治法，通過QLY加味創制“益腎清絡活血方”。該方在QLY基礎上增加菟絲子與仙靈脾以溫補腎陽；炙黃芪、當歸以補益氣血；雞血藤、紅藤行血止痛；法半夏兼顧祛痰燥濕；重用蒲公英增強基礎方的清熱之功。相對于清絡飲，該方清泄之性因補益而緩，臨床適應面更廣；以腎為綱，通過益腎固精，增強全方強骨通絡之效。其臨床應用廣泛，具有明顯的治療RA效果[12-13]。

Fig 4 Effect of YSF on expression of OPG and RANKL protein in synovial tissues of AA model rats

Tab 3 Effects of YSF on serum TNF-α，IL-1β，OPG，RANKL and OPG/RANKL in AIA model rats

文獻報道[14]，CFA誘導的RA動物模型具有穩定、可靠、價廉、易獲得的特點，在對稱關節受累、軟骨的降解破壞，滑膜炎或浸潤等方面與人的RA具有相似的臨床特征。因此，廣泛應用于抗RA藥物的臨床前藥理評價。加強注射CFA后，發現AIA大鼠的炎性癥狀逐漸加重，足爪腫脹、AI評分較高，體質量減輕。而YSF組體質量未見減輕，提示YSF不產生全身毒性。來自活化的巨噬細胞和滑膜成纖維細胞的關鍵促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等是引起RA炎癥的主要因素[15]，實驗到最后階段，發現AIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平異常升高，提示RA中AIA模型建立成功。結果示YSF下調TNF-α、IL-1β的表達，改善炎癥環境。同時YSF組組織病理學參數、MMP3及p-p65的表達較AIA組，有強大的抑制作用。此外，破骨細胞介導的骨破壞通過異常的OPG/RANKL軸發生，且OPG/RANKL的比值可以決定骨變化方向，比值越低，表明骨流失增加[16]。OPG作為一種RANKL抑制劑，是通過激活破骨細胞和骨吸收而形成破骨細胞的關鍵因子[17]。在本研究中，YSF減輕了AIA大鼠關節軟骨和骨的損傷，恢復了血清和滑膜組織[18]中RANKL水平，增加OPG水平，提高OPG/RANKL比值，可能抑制炎癥誘導的破骨形成，表明YSF對骨的保護可能與OPG/RANKL的上調有關。

綜上，本研究初步發現YSF對AIA所致關節炎局部、全身的炎癥反應和骨侵蝕具有一定的抑制作用。其機制可能與抑制炎癥因子的釋放，促進骨保護，升高OPG/RANKL途徑而減少骨損傷相關。該研究“以腎為綱”，豐富了新安醫學代表理論“固本培元”的基本內涵。然而仍存在一些局限性。需要建立更多的體內外RA模型，明確YSF治療RA的具體分子機制，分析RA的關鍵病理基因和蛋白以及后期臨床上應加強YSF的提取工藝或成分，使其在患者體內發揮更明顯的抗RA作用。