高粱根活性流分抗血小板聚集作用機制

許婉婷，周 飛，陳發菊2，，彭 梅2，，羅忠圣2，，王 麗2，，楊克鈴，楊小生2，，楊 娟2，

(1.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學，省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，3.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

目前，血栓性疾病如冠心病、心肌梗死、缺血性腦卒中等許多栓塞性疾病，已經嚴重危害了人類身心健康[1]。據有關研究顯示，全球約有20億心腦血管疾病患者，且每年死于心腦血管疾病的人數占總死亡人數的一半以上[2]，中國每年僅缺血性腦血管病患者就超過700萬[3]。近年來，血栓性疾病發病率處于上升趨勢，且越來越年輕化[4]，給社會和家庭帶來了極大的傷害。血栓性疾病發病機制復雜，受多種危險因素的影響，而血小板聚集是此類疾病的主要誘因，因此，尋找抗血小板聚集藥物，研究其作用機制，尋找發病誘因對血栓性系列疾病的治療及預防具有重大意義。課題組前期研究發現，高粱根水提醇沉上清液部位(WEAE)具有明顯的擴張血小管和抗凝血作用[5]。WEAE部分進一步經MCI凝膠柱層析，0%、30%、60%、95%乙醇洗脫得到各流分。體外抗血小板聚集活性試驗發現，30%乙醇洗脫流分(WEAE-M 30%)對膠原蛋白(collagen)、凝血酶(thrombin)、二磷酸腺苷(ADP)等激動劑誘導的血小板聚集有明顯抑制作用[6]。在前期研究基礎上，本研究對該流分抗血小板聚集作用機制進行初步探討，為進一步開發抗血栓藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SD大鼠(SPF級，體質量180～200 g)，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 藥材高粱根于2018年10月采自貴州省遵義市桐梓縣，為貴州茅臺酒股份有限公司在桐梓地區種植的酒用高粱品種紅纓子糯高粱的根，標本存放于貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室。

1.3 試劑乳酸脫氫酶試劑盒(批號：20200805)、瓊脂糖凝膠2B(批號：S8701)、鈣離子熒光探針Fura-2/AM(批號：828C011)、EGTA(批號：623P053)、TritonX-100(批號：82910211)、凝血酶(批號：72F064)均購自Solarbio公司；膠原蛋白(批號：F19000122)HYPHEN BioMed公司；二磷酸腺苷(批號：SLCB5611)、阿司匹林(批號：SLBH0714V)購自Sigma公司；PLCγ2(批號：10)、phospho-PLCγ2(批號：5)購自Cell Signaling Technology公司；Syk(批號：GR267275-19)、phospho-Syk(批號：GR286096-16)，Src(批號：GR3232598-8)、phospho-Src(批號：GR239935-26)、p38(批號：GR3215674-8)、phospho-p38(GR308415-23)、ERK(批號：GR3261666-6)、phospho-ERK(批號：GR3206456-3)均購自Abcam公司；β-actin(批號：303974)、Anti-rabbit secondary(批號：00018387)均購自Proteintech公司；PE anti-mouse/Rat CD62P(批號：B311813)購自Biolegend公司；Rat cAMP ELISA Kit(批號：GR2020-12)、Rat cGMP ELISA Kit(批號：GR2020-11)、Rat TXB2 ELISA Kit(批號：GR2021-02)、Rat 6-keto-PGF1α ELISA Kit(批號：GR2021-01)均購自武漢基因美生物有限公司。

1.4 儀器TDL-40C低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；LBY-NJ4血小板聚集儀(北京普利生儀器有限公司)；IMS-50雪花制冰機(BIOBASE公司)；NovoCyte 2040R流式細胞儀(ACEA Biosciences.Inc公司)；F97Pro熒光分光光度計(上海棱光公司)

1.5 活性部位的制備按照文獻[6]方法制備。高粱根經粉碎，加入去離子水浸泡24 h后，水煎煮提取2次，每次2 h。水煎液過濾，濾液合并濃縮后，浸膏加入適量95%乙醇，使乙醇溶液終濃度達60%，靜置后上清液過濾。減壓回收溶劑，將濃縮后的浸膏真空干燥，得水提醇沉上清液部位(WEAE)。WEAE部位再經MCI凝膠柱層析，分別采用0%、30%、60%、95%乙醇梯度洗脫，得到各洗脫流分。將30%乙醇洗脫流分(WEAE-M 30%)濃縮后真空干燥，備用。

1.6 大鼠血小板樣品制備雄性SD大鼠經腹腔麻醉后，腹主動脈取血，枸櫞酸鈉1 ∶9抗凝，800 r·min-1離心10 min，取上層富血小板血漿(PRP)[7]。PRP經Sepharose 2B瓊脂糖凝膠柱層析洗滌，得到凝膠過濾血小板(GFP)[8]。

1.7 血小板聚集功能測定根據文獻方法[9]測定血小板聚集率。將GFP分為空白組，陽性組，低、中、高劑量組。在比色杯內加入攪拌轉子，并加入270 μL GFP懸液與30 μL不同濃度WEAE-M 30%(終濃度為50、100、200 mg·L-1)，以阿司匹林(aspirin，100 mg·L-1)為陽性對照，以含0.5% DMSO的生理鹽水為空白對照，37 ℃孵育10 min。然后分別以ADP(20 μmol·L-1)、Thrombin(0.3 kU·L-1)、Collagen(2 mg·L-1)為激動劑，記錄5 min內血小板聚集儀的曲線變化，并讀取最大聚集率，按下列公式計算各受試藥對血小板聚集的抑制率。

血小板聚集抑制率/% =(空白對照組的最大聚集率-給藥組的最大聚集率)/空白對照組的最大聚集率×100 %[9]。

1.8 抗血小板聚集作用機制研究

1.8.1Western blot檢測GPVI、MAPK信號通路中蛋白表達 分別取270 μL GFP，加入30 μL不同濃度WEAE-M 30%，空白對照組、陽性對照組，孵育10 min后，用Collagen刺激5 min，得到處理好的血小板懸液。取血小板懸液，加入150 μL蛋白酶，磷酸酶抑制劑的5×RIPA裂解血小板，冰上放置30 min后，4 ℃下12 000×g離心5 min，取上清液得血小板總蛋白樣品。測定并調整血小板蛋白濃度，加入loading buffer，沸水浴5 min后，分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。將蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉后，加入對應的一抗(PLCγ2、phospho-PLCγ2，Syk、p-Syk，Src、phospho-Src，p38、p-p38，Erk、phospho-Erk，β-actin)4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜30 min，然后與抗兔二抗在室溫下孵育1 h。再次洗膜后，使用ECL發光液進行顯色曝光，灰度分析。

1.8.2ATP釋放實驗 分別取270 μL GFP(含1 mmol·L-1的CaCl2)，與30 μL不同濃度WEAE-M 30%，空白對照、陽性對照，孵育10 min，用Collagen刺激5 min后，用96孔UV板，在340 nm下，測定吸光度值。

1.8.3環磷酸腺苷(cAMP)和環磷酸鳥苷(cGMP)含量測定 按“1.8.1”操作處理好的血小板懸液，加入等體積80%冰乙醇終止反應，樣品在3 000 r·min-1離心10 min，獲取上清液，根據cAMP和cGMP含量測定試劑盒在450 nm下測定吸光度值，計算cAMP和cGMP的含量。

1.8.4胞內血栓素(TXB2)和6-keto-PGF1α水平的測定 按“1.8.1”操作處理好的血小板懸液，加入終濃度為2.5 mmol·L-1的冰EDTA和終濃度為100 μmol·L-1的吲哚美辛終止反應，懸液通過12 000×g離心3 min后[10]，在4 ℃下收集上清液，根據TXB2和6-keto-PGF1α含量測定試劑盒，在450 nm下測定吸光度值，計算TXB2和6-keto-PGF1α的水平。

1.8.5胞內鈣離子濃度測定 GFP加入5 μmol·L-1的Fura-2/AM，37 ℃孵育60 min，使Fura-2進入血小板內，并與Ca2+耦合，將Fura-2負載的血小板與WEAE-M 30%，或空白對照(含0.5 % DMSO生理鹽水)、陽性對照(Aspirin)，孵育10 min，加入Collagen刺激活化，隨即用熒光分光光度計進行初次測定，之后依次記錄加入Triton X-100后及加入EGTA后的熒光值，計算出胞內鈣離子濃度[11]。

1.8.6流式細胞術檢測血小板表面CD62P的表達 按“1.8.1”操作處理好的血小板懸液，按100 ∶1加入CD62P-PE染料，室溫暗室放置40 min，混勻，加入1%多聚甲醛200 μL固定20 min，3 500 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS重懸，上流式細胞儀檢測[12]。

2 結果

2.1 WEAE-M 30%對不同激動劑誘導大鼠血小板聚集的影響結果如Fig 1，與空白對照組比較，高(200 mg·L-1)、中(100 mg·L-1)、低(50 mg·L-1)濃度的WEAE-M 30%均能對Collagen、Thrombin、ADP誘導的血小板聚集有明顯抑制作用，差異具有統計學意義(P<0.01)，其中以對Collagen誘導的血小板聚集抑制活性最為明顯。因此后續其抗血小板聚集活性機制的探討以Collagen為激動劑。

2.2 WEAE-M 30%對Collagen介導的血小板活化通路的影響如Fig 2所示，在GPVI通路信號中，WEAE-M 30%對PLCγ2的磷酸化水平無明顯抑制作用，但表現出促進趨勢；對p-Syk水平抑制作用無明顯影響，而對p-Src水平有明顯抑制作用(P<0.01)。在MAPK通路信號中，WEAE-M 30%低、高濃度對p-p38水平有明顯抑制作用(P<0.05或P<0.01)；中、高濃度對p-ERK水平有明顯抑制作用(P<0.01)。

Fig 1 Effect of WEAE-M 30% on platelet aggregation induced by different agonists

Fig 2 Effect of WEAE-M 30% on protein expression of GPVI，MAPK pathways

2.3 WEAE-M 30%對血小板ATP釋放的影響如Fig 3所示，與空白組比較，不同濃度WEAE-M 30%對ATP釋放具有明顯抑制作用(P<0.01)，200 mg·L-1組效果最好，ATP釋放量比空白組的減少了53.00%；而Aspirin對ATP的釋放沒有明顯影響。

Fig 3 Effect of WEAE-M 30% on platelet ATP release induced by collagen

2.4 WEAE-M 30%對血小板cAMP和cGMP釋放量的影響如Fig 4所示，與空白組比較，100 和200 mg·L-1的WEAE-M 30%對血小板內cAMP和cGMP的釋放有促進作用，但差異無統計學意義(P>0.05)；陽性藥Aspirin能使血小板內cGMP含量明顯升高(P<0.01)。

2.5 WEAE-M 30%對血小板TXB2和6-keto-PGF1α含量的影響如Fig 5所示，與空白組比較，不同濃度WEAE-M 30%對TXB2水平均有明顯影響(P<0.01)，100、200 mg·L-1濃度對TXB2的水平影響相當；與陽性組比較，高、中、低劑量組均表現出明顯優勢。與空白組比較，不同濃度WEAE-M 30%對血小板6-keto-PGF1α的水平均有明顯抑制作用(P<0.01)。

2.6 WEAE-M 30%對血小板胞內鈣離子活化的影響與空白組比較(Fig 6)，不同濃度WEAE-M 30%對血小板鈣離子活化均有明顯影響(P<0.01)，表現為抑制鈣離子活化；在WEAE-M 30%濃度為200 mg·L-1時效果最好，鈣離子濃度僅為(52.50±5.57) nmol·L-1，比陽性組減少了85%。

2.7 WEAE-M 30%對血小板P-selection表達的影響結果如Fig 7所示，與空白組比較，在WEAE-M 30%濃度為50、200 mg·L-1時，對血小板P-selection表達有明顯抑制作用(P<0.05)，在濃度為100 mg·L-1，無明顯影響；與陽性組比較，抑制活性較弱。說明WEAE-M 30%在Collagen誘導下對P-selection表達有一定的抑制作用，但抑制活性低于陽性組。

Fig 4 Effect of WEAE- M 30% on platelet cAMP and cGMP release induced by collagen

Fig 5 Effect of WEAE-M 30% on contents of TXB2 and

Fig 6 Effect of WEAE-M 30% on intracellular calcium ion concentration of platelets induced by collagen

3 討論

糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)為血小板膜糖蛋白受體，僅在血小板和巨核細胞表達，GPⅥ可由膠原等激動劑誘導活化，繼而引起顆粒內容物的釋放和血小板內的信號轉導[13]。在血小板中，Fc-受體-γ鏈與GPVI受體均可表達，當GPVI與膠原蛋白結合時，Src家族激酶被激活而引起Syk的酪氨酸磷酸化，此時兩銜接蛋白將PLCγ2等連接在一起從而形成復合物，且活化PI3K、PLCγ2蛋白，激活其共同活化途徑的整合素αIIbβ3。αIIbβ3進一步導致MAPK家族中JNK、ERK和p38磷酸化，最后引起血小板活化、聚集、釋放等反應[14-15]。本研究中，WEAE-M 30%對Collagen介導的血小板GPVI信號通路蛋白Src，MAPK信號通路蛋白p38、ERK蛋白磷酸化水平的表達均有明顯抑制作用。目前，已發現多種抗血小板聚集作用的相關機制，例如增加血小板細胞內cGMP與cAMP含量，抑制花生四烯酸(AA)的生成以及MAPK、NO、ATP酶的活性等[16]。cGMP和cAMP水平在正常情況下處于動態平衡，當血小板細胞內cGMP、cAMP水平稍有升高就會明顯抑制血小板ATP釋放、抑制血栓素合成、降低鈣離子濃度以及抑制血小板活化[17]。當血小板被激活時，花生四烯酸(AA)會形成不穩定的過氧化物PGG2和PGH2，在血栓素合成酶(TXAS)和PGI2合成酶的催化作用下兩者分別形成血栓烷素TXA2和PGI2。TXA2可引起血管收縮和血小板聚集，PGI2可增加cAMP的含量，從而抑制血小板聚集。由于TXA2和PGI2性質非常不穩定，迅速代謝難以被檢測，因此人們常對二者相對穩定的代謝產物TXB2和6-Keto-PGF1α的濃度變化程度來反映血小板的活化狀態。血小板顆粒的釋放也是其活化過程的重要步驟，當血小板活化時，血小板需將原存儲于血小板內的α-顆粒、致密顆粒和溶酶體中的成分釋放到血小板外，其中從致密顆粒內釋放出來的成分主要包括ATP、Ca2+、ADP以及5-HT等[6]。本研究中的WEAE-M 30%可明顯抑制ATP、Ca2+、血栓素TXB2的釋放水平。P-selection是存在于血小板α顆粒膜上的一種糖蛋白，血小板活化后，P-selection在細胞表面迅速表達，釋放α粒子，導致白細胞黏附[18]。本研究中的WEAE-M 30%可明顯抑制的P-selection釋放水平。

綜上所述，WEAE-M 30%抗血小板聚集作用可能是通過抑制血小板活化通路GPVI、MAPK蛋白Src、p38、ERK磷酸化表達水平，以及抑制血小板典型代表顆粒ATP、P-selection、Ca2+的釋放而發揮其活性作用。

Fig 7 Effect of WEAE-M 30% on CD62P expression in platelets induced by collagen *P<0.05，**P<0.01 vs blank