線蟲在軌液體培養(yǎng)熒光觀測關鍵參數研究

王 巍， 元姝棋， 邱 輝， 盧盈宇， 張 普， 鐘潤濤， 孫野青*

(1.大連海事大學環(huán)境科學與工程學院環(huán)境系統(tǒng)生物學研究所， 大連 116026；2.北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院， 北京 100089)

1 引言

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，C. elegans)個體小，其成蟲體長僅1 mm，全身透明，以細菌為食，全身共有不到1000 個細胞，性別為雌雄同體或雄性，繁殖周期短，既可以在固體線蟲生長培養(yǎng)基(Nematode Growth Medium，NGM)上生長，也可以在液體培養(yǎng)基(C. elegansMaintenance Medium，CeMM)中生長。 野生型N2 線蟲在固體培養(yǎng)基上發(fā)育至成蟲(經歷L1、L2、L3、L4 四個時期)僅需2～3 d，在液體培養(yǎng)基中發(fā)育至成蟲只需6～7 d[1]。 線蟲的一些組織可用基因工程手段融合熒光蛋白來進行熒光標記，例如用熒光標記線蟲的體壁肌肉組織、中樞神經系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等，這些熒光標記的線蟲可以用來進行針對性的研究。 線蟲對于空間輻射和微重力的感知與人類及一些哺乳動物在細胞水平相似[2]，并且在空間環(huán)境中具有耐受性好、生保需求少、樣品收集簡單、易于觀察等優(yōu)點。 由此可見，秀麗隱桿線蟲是用來研究空間生物學效應的一種理想模式生物。

從1992 年的航天飛機(Space Transportation System，STS)計劃到2004 年的首次線蟲國際飛行實驗(InternationalCaenorhabditis elegansExperiment First Flight，ICE-FIRST)以及中國的神舟八號和實踐十號飛行任務已進行多次空間線蟲搭載實驗，但樣品都為L1 期線蟲幼體或道爾期線蟲，實驗結束后線蟲樣品返回時已為世代混合狀態(tài)或未發(fā)育的道爾期狀態(tài)，未實現單條線蟲在軌完整的生命周期觀察。 為了在中國空間站實現單線蟲在軌發(fā)育的全周期培養(yǎng)和觀測，本研究團隊設計了利用微流控芯片對線蟲進行基于液體培養(yǎng)體系的自動化無菌培養(yǎng)方案[3]。 選用了CeMM 來培養(yǎng)線蟲，建立了固體培養(yǎng)轉為液體培養(yǎng)的方法[1]，馴化了來源為固體NGM 生長的N2 野生型線蟲，馴化后的線蟲可在完全無菌的狀態(tài)下生長繁殖，明確了野生型線蟲在CeMM 中的生長環(huán)境以及生長發(fā)育指標測量的方法。 為了避免出現線蟲在發(fā)射上行和在軌實驗等待過程中無法有效觀測發(fā)育和產卵等情況，前期實驗也明確了利用12 ℃低溫進行在軌前線蟲發(fā)育控制，在軌實驗時再轉移至20 ℃正常觀測的方案[1]。

空間的復雜環(huán)境尤其是輻射和微重力對線蟲的DNA 損傷、細胞凋亡、肌肉和神經損傷的影響在發(fā)育過程中的動態(tài)變化過程，有必要進一步在空間開展分子水平的觀測和驗證。 這些研究需要實現線蟲的長期在軌自動化培養(yǎng)以及對線蟲相關通路熒光標志物的觀察。 空間在軌的熒光觀測實驗由于技術限制等因素結果較少，Lei 等[4]在實踐十號空間研究中搭載了一種帶有可編程控制溫度、自動顯微照相和樣品固定的小鼠胚胎微型培養(yǎng)箱，可以對小鼠的胚胎細胞分裂進行在軌觀測。目前還沒有在軌對線蟲組織層面熒光觀測的相關研究，需要在平臺上實現硬件的構建，因此構建熒光觀測的方法和實驗條件都需要地面實驗來進行驗證。

本文篩選代表性的熒光標記線蟲，并建立在CeMM 中馴化熒光標記線蟲和獲取熒光成像指標的方法。 實驗分別在12 ℃和20 ℃下測量熒光線蟲發(fā)育過程的體長、體寬、壽命、產卵周期和泳動頻率，獲得熒光線蟲在發(fā)育時期的熒光觀測條件和數據，為利用線蟲進行空間站在軌培養(yǎng)及觀測的硬件設計和技術要求提供輸入條件。

2 材料與方法

2.1 線蟲材料和篩選

秀麗隱桿線蟲品系均購自美國線蟲遺傳中心(CaenorhabditisGenetics Center，CGC)。

針對在軌發(fā)育的線蟲主要進行輻射和微重力協同效應的分析，除野生型線蟲外，可以利用微重力感受或輻射感受關鍵基因熒光標記位點的定性和定量分析進行效應的觀測。 為了建立熒光線蟲培養(yǎng)和觀測的方法，調研了對微重力與輻射產生響應并攜帶熒光標記位點的線蟲。 目前利用線蟲進行微重力效應的研究主要集中在肌肉萎縮、運動神經系統(tǒng)與壽命方面[5-7]。 利用線蟲進行輻射損傷效應研究主要集中在基因組突變[8-9]、細胞凋亡[10]、免疫水平[11]、氧化脅迫[12]等方面。 對參與以上通路的十幾種關鍵基因具有熒光標記的線蟲進行篩選(全身或局部大范圍組織能觀測到熒光)，并利用CeMM 進行長期(≥4 個月)的馴化得到本文所用2 種熒光標記線蟲AM141和CZ13799。

2.2 CeMM 配制

CeMM 是多次用在國際空間站進行線蟲培養(yǎng)和觀察的標準培養(yǎng)基，無菌無嗅，包含線蟲生長所需的全部營養(yǎng)元素，主要成分包括維生素、無機鹽、氨基酸、核苷酸、脂質和葡萄糖等。 配制采用Szewczyk 等[13]的化學定義線蟲培養(yǎng)基配制方法。

2.3 CeMM 培養(yǎng)線蟲的馴化及同步化

為了得到適應CeMM 液體生存環(huán)境的線蟲，需要從NGM 上將線蟲轉移至CeMM 并進行馴化。馴化過程主要包括同步化得到蟲卵、將蟲卵轉移至小體系CeMM 中除菌培養(yǎng)、初代成蟲獲取、多次連續(xù)同步化和培養(yǎng)直至線蟲培養(yǎng)體系穩(wěn)定不染菌，線蟲發(fā)育過程穩(wěn)定在固定期間內。 獲取到馴化成功的線蟲后，可使用CeMM 進行大體系培養(yǎng)[1]。 線蟲同步化采用氫氧化鈉/次氯酸鈉裂解法[1]。

2.4 CeMM 培養(yǎng)線蟲發(fā)育過程生理指標分析

測量生長發(fā)育過程指標包括從幼蟲發(fā)育至成蟲的體長和體寬的增長、產卵周期和壽命，為微流控芯片尺寸設計提供參考支持。 測量體長時選取線蟲身體的中間位置，測量體寬時選取線蟲咽部位置利用畫線法測量。 測量產卵周期時選取單條線蟲每天連續(xù)跟蹤觀察，從出現子代幼蟲起至子代產卵為止。 壽命測量使用5-氟尿嘧啶(FudR，5-fluoro-2′-deoxyuridine) 抑制產卵，選取單條線蟲每天連續(xù)跟蹤觀察線蟲是否存活，繪制存活曲線[1]。 實驗分別在20 ℃和12 ℃兩種溫度下測量。

2.5 CeMM 培養(yǎng)線蟲發(fā)育過程中泳動頻率測量

線蟲在CeMM 中的運動狀態(tài)呈現為頭部和身體的隨機快速左右擺動，而非在固體培養(yǎng)基上的正弦曲線擺動。 因此通過泳動頻率即每分鐘左右各擺動一次的數目來體現線蟲在液體培養(yǎng)基中的運動能力。 泳動頻率將直接體現線蟲受到空間微重力影響的效應。 線蟲同步化后得到L1 期幼蟲，在PCR 管內分裝培養(yǎng)，管內個體數大于5 條，分為兩組(12 ℃和20 ℃)，黑暗培養(yǎng)。 每天從每組中取5 條線蟲進行視頻錄制，統(tǒng)計線蟲每10 s的泳動次數(線蟲左右彎曲1 次計為1 次泳動)，共測量5 次。 計算5 次泳動次數的平均值，將該數值乘以6，即為線蟲每分鐘的泳動頻率。 統(tǒng)計至線蟲生長為成蟲并且產卵后不能區(qū)分當代和子代為止。

2.6 熒光測量及分析方法

2.6.1 熒光成像

線蟲同步化后得到L1 期幼蟲并分裝培養(yǎng)(同2.5 節(jié))，測量時將線蟲吸取至載玻片，使用灼燒法固定，熒光顯微鏡測定熒光表達水平(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長510 nm)。 曝光時間為300 ms 或600 ms，4×及10×物鏡放大，對線蟲個體熒光成像跟蹤至線蟲發(fā)育為成蟲。

2.6.2 熒光數據分析方法

利用Image-Pro Plus 6.0 軟件，將熒光圖轉化為灰度圖，選擇需要測量的區(qū)域，測量熒光成像圖片的累積光密度(Integrated Optical Density，IOD)。

3 結果與討論

3.1 熒光線蟲的篩選、馴化

通過篩選并利用CeMM 進行長期(≥4 個月)馴化后，選定了2 種參與微重力響應通路的關鍵分子(unc-54 和unc-25)上帶有YFP(Yellow Fluorescent Protein)或GFP(Green Fluorescent Protein)熒光標記的線蟲AM141 和CZ13799(表1)，作為本文用于建立熒光標記線蟲在軌培養(yǎng)觀測方法的初步樣品。

表1 熒光標記線蟲特征Table 1 Characteristics of fluorescent labeled C.elegans

AM141[rmIs133 (unc-54p::Q40::YFP)][14]為肌球蛋白重鏈unc-54 基因熒光標記線蟲，在unc-54 基因后連入了40 個poly Q 重復片段構建而成。 隨著發(fā)育，poly Q 在體壁肌肉層聚集，引起線蟲肌肉蛋白功能喪失，產生運動障礙從而出現運動能力減退現象。 poly Q 片段后融合了YFP，因而可以在熒光顯微鏡下觀察到線蟲體壁熒光。該品系線蟲通常被用來研究微重力對肌肉系統(tǒng)的影響，Qiao 等[15]利用AM141、HA759 等微重力敏感品系在神舟八號飛行和地面模擬微重力條件下對線蟲的運動能力和生殖能力進行了研究，但未發(fā)現空間飛行對線蟲產生顯著性影響。

CZ13799[juIs76 (unc-25p::GFP) ＋lin-15(＋)]為谷氨酸脫羧酶unc-25 基因熒光標記線蟲，即GABA 生物合成酶[16]，在該基因后融合GFP，使熒光在GABA 能神經元中表達。 研究者通常使用該基因進行運動神經系統(tǒng)的研究。 Xu等[17]研究發(fā)現維持谷氨酸能和γ-氨基丁酸能(GABAergic)系統(tǒng)之間的平衡可以減輕小鼠尾懸吊(模擬微重力效應)引起的認知和神經缺陷。

將購置于CGC 線蟲品系庫的AM141 和CZ13799 線蟲從NGM 固體培養(yǎng)基上進行了擴繁和同步化培養(yǎng)，將L1 幼蟲進行了CeMM 馴化。通過20 次(不短于4 個月)的連續(xù)馴化和無菌篩選，AM141 和CZ13799 線蟲可以適應CeMM 并穩(wěn)定正常生長及傳代(圖1)。 馴化后的線蟲在CeMM 中的發(fā)育周期(從卵至成蟲)穩(wěn)定，AM141的發(fā)育周期為(10±1)d，CZ13799 的發(fā)育周期為(8±1)d(圖2)。

圖1 適應CeMM 的AM141 和CZ13799 線蟲生存狀態(tài)Fig.1 Survival status of AM141 and CZ13799 adapted to CeMM

圖2 馴化后的線蟲在CeMM 中的發(fā)育過程Fig.2 Development process of the domesticated nematode in CeMM

3.2 發(fā)育指標分析

3.2.1 體長與體寬

在得到馴化成功的熒光線蟲后，跟蹤了CeMM 培養(yǎng)的野生型線蟲(N2)及兩種熒光線蟲(AM141，CZ13799)在20 ℃和12 ℃溫度下發(fā)育過程的體長和體寬的變化情況。 從L1 期開始記錄，進行至線蟲生長為成蟲為止。 每天統(tǒng)計線蟲個數不等，最少為8 條，統(tǒng)計結果見圖3、圖4。

圖3 野生型線蟲和AM141、CZ13799 熒光線蟲在20 ℃下發(fā)育的體長體寬對比Fig.3 Comparison of body length and body width of N2 and AM141， CZ13799 nematodes under 20 ℃

圖4 野生型線蟲和AM141、CZ13799 熒光線蟲在12 ℃下發(fā)育的體長、體寬對比Fig.4 Comparison of body length and body width of N2 and AM141， CZ13799 nematodes under 12 ℃

從3 種線蟲的體長、體寬發(fā)育趨勢數據可以發(fā)現:20 ℃下，N2 和CZ13799 兩種線蟲的平均發(fā)育時間為8 d，而AM141 的平均發(fā)育時間較長，達到了10 d。 12 ℃下，N2 和CZ13799 兩種線蟲的平均發(fā)育時間為18 d，而AM141 的平均發(fā)育時間較長，達到了21 d。 兩種溫度下線蟲發(fā)育至成蟲后的尺寸比較為CZ13799 ＞N2 ＞AM141。 相比于20 ℃，在12 ℃低溫下N2 和CZ13799 兩種線蟲發(fā)育至成蟲的體長、體寬減少，而AM141 成蟲的體長和體寬卻增加。

從野生型和兩種熒光標記線蟲的體長體寬發(fā)育趨勢中可以看到，線蟲在20 ℃和12 ℃兩種溫度下都可以發(fā)育到成蟲，但環(huán)境溫度為12 ℃時線蟲從L1 期至成蟲的發(fā)育時間明顯延緩了10 d以上。

3.2.2 產卵周期

對于產卵量(表2)，20 ℃下N2 與AM141 數量接近，CZ13799 顯著性多于前兩品系；12 ℃下N2 產卵量與AM141 相較于20 ℃時沒有顯著性減少，但CZ13799 線蟲產卵量減少一半以上。

表2 野生型線蟲和AM141、CZ13799 熒光線蟲在兩個溫度下的產卵量對比Table 2 Comparison of egg yield of N2 and AM141，CZ13799 nematodes under two temperatures

對于產卵周期每天統(tǒng)計線蟲個數不等，最少為10 條，統(tǒng)計結果見圖5。 由圖可以看出，20 ℃下AM141 的產卵起始(第8 天) 晚于N2 和CZ13799(第6 天)，并且產卵的持續(xù)時間明顯延長；12 ℃下所有線蟲產卵開始的時間后移1 周左右，并且AM141 的產卵起始仍晚于 N2 和CZ13799，并一直延長至第36 天。

圖5 野生型線蟲和AM141、CZ13799 熒光線蟲在兩個溫度下產卵情況對比Fig.5 Comparison of egg laying of N2 and AM141，CZ13799 nematodes under two temperatures

3.2.3 線蟲壽命

若要在CeMM 中對線蟲進行長期連續(xù)的壽命跟蹤，就需要排除子代生長對母代的干擾，所以本文實驗利用五氟尿嘧啶來抑制線蟲產卵[18]。

在20 ℃狀態(tài)下，N2 平均壽命為48 d，CZ13799 平均壽命為43 d，AM141 平均壽命為41 d；在12 ℃狀態(tài)下，N2 平均壽命為69 d，CZ13799 平均壽命為62 d，AM141 平均壽命為60 d。

從3 種線蟲的存活曲線可以發(fā)現(每個采樣點統(tǒng)計線蟲條數不少于100，見圖6):20 ℃狀態(tài)下，3 種線蟲的平均壽命都在1 個月以上，最長可達70 ～80 d；N2 線蟲壽命要長于CZ13799 和AM141。 12 ℃狀態(tài)下，野生型和熒光線蟲的平均壽命都可達到2 個月以上，最長可達100 ～120 d；3 種線蟲的平均壽命在低溫下延長約20 d 左右，低溫環(huán)境在延緩線蟲發(fā)育的同時，線蟲的壽命也相應增長，N2 線蟲壽命長于CZ13799 和AM141，AM141 平均存活時間最短。

圖6 野生型線蟲和AM141、CZ13799 熒光線蟲在兩個溫度下壽命對比Fig.6 Comparison of longevity of N2 and AM141，CZ13799 nematodes under two temperatures

3.2.4 泳動頻率

在20 ℃和12 ℃下，分別對野生型線蟲和熒光線蟲進行平均泳動頻率統(tǒng)計，從線蟲L1 期開始，至發(fā)育至成蟲結束(表3)。 由表中可以看出，20 ℃和12 ℃下，野生型線蟲的平均泳動頻率均高于2 種熒光線蟲，綜合比較為N2 ＞AM141 ＞CZ13799。 3 種線蟲在20 ℃下的平均泳動頻率都高于12 ℃狀態(tài)下的平均泳動頻率，低溫條件降低了線蟲的運動水平。

表3 野生型線蟲和AM141、CZ13799 熒光線蟲在2 個溫度下的平均泳動頻率對比(n＝5)Table 3 Comparison of average swimming motility of N2 and AM141， CZ13799 nematodes under two temperatures (n＝5) 次/min

對每一種線蟲在20 ℃和12 ℃下的發(fā)育指標的分析可以發(fā)現:相對于20 ℃常規(guī)培養(yǎng)溫度，12 ℃低溫下線蟲也能夠正常存活和發(fā)育并完成生命周期。 但在12 ℃下，線蟲的發(fā)育周期延長，從L1 幼蟲至成蟲可以持續(xù)2 ～3 周，這個過程中沒有卵的產出和子代的發(fā)育，利用微流控芯片培養(yǎng)時不會對芯片通道造成影響和阻礙，因此可以作為空間在軌實驗前如發(fā)射場等待、上行、在軌對接等過程的保持溫度。

不同的熒光線蟲發(fā)育時期的體長、體寬、產卵、壽命與野生型相比都有一定區(qū)別，因此在軌的換液頻率與觀測時間與野生型相比需要不同的流程。 目前兩種熒光標記線蟲的體長、體寬與野生型相比變化范圍在10%左右，在微流控芯片設計角度需要進一步考慮該問題。

3.3 熒光線蟲的熒光指標及發(fā)育過程中的變化

3.3.1 熒光標記線蟲的熒光狀態(tài)

利用光源為激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長510 nm 的熒光顯微鏡進行熒光成像，兩種熒光線蟲的熒光狀態(tài)如圖7 所示。 在10 倍物鏡放大下可清晰看到AM141 線蟲體壁的熒光點分布，該熒光點即為融合了黃色熒光蛋白的unc-54p::Q40 聚集點。 CZ13799 線蟲也可觀察到神經網的分布。

圖7 AM141、CZ13799 兩種線蟲熒光狀態(tài)(10×)Fig.7 Fluorescence status of AM141 and CZ13799 nematode (10×)

根據在軌實驗裝置熒光成像技術指標的要求，裝置實際的物鏡放大倍數在1.7 ～2.5 倍左右，因此利用實驗室最低物鏡4 倍(換算實際放大倍數為2.66 倍)進行成像，曝光時間分別設定為300 ms 和600 ms。 最終明確600 ms 的成像曝光時間能夠基本滿足2 種熒光線蟲的在軌發(fā)育過程成像需求(圖8)，能夠實現線蟲熒光強度的測量。

圖8 AM141、CZ13799 兩種線蟲熒光狀態(tài)(4×)Fig.8 Fluorescence status of AM141 and CZ13799 nematode (4×)

AM141 和CZ13799 線蟲在20 ℃和12 ℃下從L1 至成蟲發(fā)育過程中的熒光狀態(tài)如圖9、10所示。

圖9 AM141 線蟲在20 ℃和12 ℃發(fā)育過程熒光成像(4×)Fig.9 Fluorescence imaging of AM141 during development under 20 ℃and 12 ℃( 4×)

在20 ℃和12 ℃兩種溫度下，AM141 和CZ13799 線蟲在發(fā)育過程中基本可實現熒光成像。 20 ℃時，由于前兩天線蟲體型較小，AM141和CZ13799 線蟲的熒光點在4 倍時較為模糊，在第3 天后可以觀察清楚；12 ℃時則為第11 天以后可觀察清楚。 此結果可以作為在軌線蟲加載和熒光觀測時間節(jié)點限制的輸入條件。 在20 ℃和12 ℃下，4 倍成像均可實現發(fā)育過程中熒光強度的測量。

3.3.2 線蟲發(fā)育過程的熒光強度變化

圖10 CZ13799 在20 ℃和12 ℃發(fā)育過程熒光成像(4×)Fig.10 Fluorescence imaging of CZ13799 during development under 20 ℃and 12 ℃(4×)

為了進一步驗證低倍顯微放大能否分析出線蟲發(fā)育過程中的熒光強度的變化，對熒光線蟲累積光密度進行測量，物鏡放大倍數選擇為4 倍。 初步能夠得到AM141 與CZ13799 兩種熒光線蟲在兩種溫度下發(fā)育過程中的熒光強度累積光密度(IOD)變化，繪制散點圖并添加趨勢線，如圖11、12 所示(線蟲每天統(tǒng)計條數為3)。

圖11 兩種溫度下AM141 發(fā)育過程中的熒光強度變化Fig.11 Changes in fluorescence intensity of AM141 during development under two temperatures

由以上兩種線蟲發(fā)育過程中全身熒光強度的散點圖可以看出，在20 ℃和12 ℃兩種溫度條件下，兩種線蟲的熒光強度都隨著時間的增長而增強，說明4 倍成像可以對兩種熒光線蟲發(fā)育過程中的全身熒光變化進行監(jiān)測。

對于AM141 來說，12 ℃低溫對發(fā)育到成蟲的線蟲熒光表達沒有明顯的影響(成蟲平均熒光強度均在3×106量級)；而對于CZ13799 線蟲，12 ℃低溫對成蟲的熒光表達產生了影響(由20 ℃的3.5×106降低到12 ℃的2×106)，說明CZ13799 線蟲的神經發(fā)育狀態(tài)可能會被低溫所抑制。

圖12 兩種溫度下CZ13799 發(fā)育過程中的熒光強度變化Fig.12 Changes in fluorescence intensity of CZ13799 during development under two temperatures

4 結論

本研究基于中國空間站微流控芯片培養(yǎng)并監(jiān)測線蟲的需求，建立了篩選空間環(huán)境敏感熒光標記線蟲和熒光成像分析的方法，并研究不同線蟲品系在發(fā)育過程中的生理指標差異，為在軌液體培養(yǎng)和熒光觀測提出關鍵參數:

1)本文研究篩選具有微重力感受或輻射感受關鍵基因熒光標記位點的熒光線蟲，線蟲需全身或局部大范圍組織能產生熒光，并能通過CeMM 進行長期(≥4 個月)的馴化，篩選出兩種熒光標記線蟲AM141 和CZ13799。

2)不同熒光標記線蟲的體長、體寬與野生型相比變化范圍在10%左右，在微流控芯片通道設計需要考慮該變化；不同的熒光線蟲發(fā)育時期的產卵、壽命與野生型相比均有區(qū)別，因此在軌的換液頻率與觀測時間與野生型相比需要不同的觀測流程。

3)AM141、CZ13799 兩種線蟲熒光參考觀測的激發(fā)波長為488 nm、曝光時間為600 ms，4 倍低倍物鏡可以監(jiān)測熒光線蟲發(fā)育過程中的全身熒光強度變化。

4)12 ℃溫度環(huán)境可以延長野生型線蟲及熒光線蟲的發(fā)育周期，延緩產卵起始時間和壽命，可以作為空間在軌實驗前如發(fā)射場等待、上行、在軌對接等過程的保持溫度。