RBF神經網絡與癌細胞黏附度活性檢測研究

李 丹

南京中醫藥大學附屬南京醫院 南京市第二醫院檢驗科，江蘇省南京市 210003

細胞活性評估技術在抗癌新藥物測試[1]、細胞毒理學實驗[2]以及其他生化反應刺激實驗[3]中起著至關重要的作用。傳統細胞活性評價方法是細胞計數法[4]，即活細胞占總細胞數量的百分比。然而，由于細胞群體的異質性，傳統的細胞計數法已經不能滿足藥物劑量實驗的精度要求。因此，如何評估細胞群體的異質性問題，是本論文需要解決的重要的科學問題。眾所周知，細胞與其物理環境之間的黏附作用是發育生物學[5]、組織工程[6]與生物技術過程[7]中的核心，同時細胞黏附性還是細胞轉移[8]、細胞活性[9]以及細胞凋亡[10]的物理標志，因此，細胞黏附強度被認為是量化評估細胞狀態的重要物理指標之一[11]。通過對細胞黏附性的檢測，可實現對細胞狀態無標記、非侵入性與實時的監測，因此，本論文考慮將細胞黏附性作為評估細胞異質性的方案。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、試劑與裝置 人胃癌細胞(SGC-7901)由南京第二醫院提供，培養基(DMEM+10% FBS)從美國Gibco公司購買，細胞在37℃，5%CO2環境的水套式二氧化碳培養箱(購買自Heal Force?)內培養。30%濃度的H2O2與純度65%的順鉑[化學式：PtCl2(NH3)2]試劑購買自MOLBASE公司；CCK-8細胞凋亡檢測試劑盒購買自美侖科技公司。

離心機購買自上海盧湘儀離心機儀器有限公司，可調節旋轉角速度(ω<10 000rad/min)。微流控芯片由汶灝芯片技術有限公司(中國蘇州)制造，如圖1所示。離心式微流控芯片采用PDMS材料作為基材，含約105cells/ml細胞密度的培養基滴入芯片的入口，將芯片放入二氧化碳培養箱中培養12h，使細胞在離心式微流控芯片的通道中黏附。

圖1 離心式微流控芯片的制作

1.2 實驗方法 首先將同一批培養的細胞樣本分為樣本A和樣本B，樣本A利用離心式微流控芯片進行細胞黏附脫離實驗，樣本B在96孔板中進行細胞活性檢測實驗。兩個細胞樣本各自分為六組子樣本，分別用10μl不同濃度(0、10、50、100、200、500μmol/L)的H2O2培養3h，以建立細胞活性梯度，將滴入0μmol/L H2O2的樣本作為控制組。(1)細胞黏附脫離實驗：通過改變芯片的轉速以改變貼附細胞所受離心力，弱黏附性的細胞會被較弱的離心力脫離，強黏附性的細胞會被較強的離心力脫離，從而建立細胞受離心力影響的黏附脫離動力曲線圖。用Origin2016軟件對該曲線進行Logistic擬合，得到S型函數f(x)。分別令f(x)=0.2、0.5、0.8，得到細胞黏附強度值τ20、τ50與τ80。(2)細胞活性檢測實驗是用抗癌藥物順鉑進行，將10μl不同濃度(0～300μmol/L)的順鉑試劑滴入96孔板中，培養24h，然后進行CCK-8實驗；以順鉑溶液濃度作為x軸，以酶標儀計算的細胞指數作為y軸制作藥物劑量反應曲線圖(S型曲線)。用Origin2016軟件對該曲線進行Logistic擬合，得到S型函數g(x)。令g(x)=0.5，得到細胞活性值IC50。(3)信息融合：將細胞多黏附強度值作為輸入，細胞活性值作為輸出，利用RBF神經網絡建立細胞活性預測模型。

1.3 數據統計分析 所有實驗數據均獨立重復20次，均具有統計學意義，即P<0.05(n=20)，其中P是指采樣誤差引起的樣品之間的差異。

2 結果

2.1 細胞離心力 本文中利用離心力對群體細胞的異質性等級進行劃分，突破了傳統的細胞計數方法評估細胞活性的弊端。如圖2所示，在離心式微流控芯片環形通道內的細胞平均受力為[12]：

圖2 黏附細胞受離心力模型

其中，τ為細胞所受的離心力，r為細胞與芯片中心的距離，ρ為培養基的密度(998.5kg/m3)，μ為培養基黏度(0.085dynes·cm-2·s)[13]，ω為離心式微流控芯片旋轉的角速度。

2.2 細胞黏附強度信息提取 細胞在離心式微流控芯片環形通道內培養貼壁，控制轉盤轉速以改變離心力，每次持續12min，然后對環形通道內的細胞進行計數，除去最初的細胞數量(控制組)得到細胞指數。將得到的數據用Origin2016進行Logistic函數(S型曲線)擬合，得到圖3。其中Logistic函數表達式為：

圖3 不同活性梯度下離心力對細胞指數的影響

對圖3擬合的結果見表1。

表1 Logistic函數擬合參數表

其中，所有擬合的確定系數(R-Square)均>0.99，同時校正確定系數(Adj.R-Square)也均>0.99，說明圖3中的曲線達到了很好的擬合。

根據曲線的擬合，可以計算細胞的黏附強度。τN表示細胞脫離(100-N)%所受的離心力，以此來評估細胞群體的黏附強度。然而，用單一參數評估細胞群體的異質性存在一定的誤差，因此，提取τ20、τ50與τ80等三個細胞黏附強度參數，并用RBF神經網絡來擬合輸出(細胞藥物反應實驗)，以達到精確評估與預測細胞活性的目的，根據公式(2)、圖3與表1可計算出τ20、τ50與τ80等三個細胞黏附強度參數。

2.3 細胞活性標定 提高細胞活性評估的準確性，有助于提高新抗癌藥物的測試[1]，這也是細胞活性研究領域最重要的目標之一。而細胞活性評估的標準方法，是用抗癌藥物對癌細胞進行半抑制率(half maximal inhibitory concentration)IC50的測定[14]。這里，采用順鉑作為藥物反應實驗的試劑，順鉑主要應用于SGC-7901等腫瘤細胞的治療[15]。用不同濃度的H2O2在96孔板中制備細胞活性梯度，然后進行藥劑反應實驗，順鉑濃度范圍為(1～300μmol/L)，得到藥物反應曲線，如圖4所示。用Graphpad Prism 7.0軟件可直接計算出IC50的值，具體步驟為：(1)輸入數據，點擊analyze→ 點擊Transform concentration[x]；(2)選擇Transform to logarithms；(3)點擊analyze→點擊Dose-response-Inhibition→點擊Log(inhibitor)vs.response-Variable slope(for parameters)。利用該方法計算的IC50的值見表2，作為RBF神經網絡的輸出。

圖4 藥物反應實驗

表2 IC50的計算

2.4 基于RBF神經網絡的細胞活性評估 將細胞黏附強度τ=[τ20、τ50、τ80]作為RBF神經網絡的輸入，將抗癌藥物反應實驗的IC50值作為RBF神經網絡的輸出，調用MATLAB程序：net=newrb(X_train,Y_train, spread)，其中spread為徑向基函數的分布密度，這里使spread=1.5。應用訓練好的模型對細胞活性進行預測，得到圖5，并與傳統細胞計數方法進行比較。

由于群體細胞的異質性，以細胞數量作為評價細胞活性的方法會造成藥物反應的巨大誤差。由圖5可知，細胞被不同濃度的H2O2弱化[16]，雖然還是活的細胞，但是其抗藥物的能力明顯降低。黏附強度作為描述細胞狀態強有力的物理參數，通過RBF神經網絡將三種黏附強度參數融合在一起，綜合評價細胞活性，使得細胞活性得到更精確的評估與預測。結果表明，相比于傳統細胞計數法的平均誤差19.0%，基于多黏附強度信息融合方法與標準方法IC50法的誤差更小，平均誤差為1.8%，提高了17.2%，如表3所示。因此，本文提出的細胞活性評估方法，對抗癌新藥物測試、細胞毒理學試驗以及其他生化刺激的劑量反應試驗具有重大意義。

圖5 細胞活性評估方法對比

表3 細胞計數法、信息融合法與IC50法比較

3 討論

細胞的黏附強度是細胞活性重要的物理標志之一，我們制備一種離心式微流控芯片，通過施加不同離心力，同時用細胞計數法統計細胞脫離情況，得到細胞指數與離心力大小之間的曲線關系。結果發現，受較大離心力脫離的細胞都是屬于特異性黏附，因為非特異性黏附細胞的黏附狀態太弱，易被較弱的離心力沖走，因此表明該項實驗具有生物學意義。本文從細胞黏附脫離動態曲線中提取三種黏附強度，表明此方法可以實現細胞群的黏附異質性的評估，且提取的黏附強度參數越多，其表征細胞群黏附強度的梯度越精確。由于細胞所受離心力被位置所限制，因此離心式微流控芯片的通道寬度設計不能超過三個細胞的直徑，否則會造成黏附細胞受力不一致；同時，窄通道的設計也有利于細胞計數。另外，細胞對藥物的反應能力不只體現在死活上，每個細胞活性狀態不一樣，因此存在活性異質性問題。結果表明，利用細胞群的多黏附強度信息評估細胞活性，相比于傳統僅以死活評價的細胞計數法，其評估細胞藥物反應的精確度大大提高。

由于細胞黏附強度的提取需要細胞在微流控芯片中貼壁，貼壁時間大約12h，無法實現細胞活性的快速提取，因此，未來我們將考慮利用縮窄微通道實現單細胞黏附強度的高通量提取，以提升細胞活性評估的效率。另外，雖然本文提取了細胞的多黏附強度信息，但是仍然屬于單一的胞外物理特征，將來若結合電化學方法提取細胞膜電容性、胞質濃度或細胞內部電位等信息，并利用深度學習將之融合在一起，則可實現細胞活性更加全面精準的評估。