ICP-MS 測(cè)定補(bǔ)腎填精口服液中30 種無(wú)機(jī)元素的分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

湯遜尤，孫輝，丁野，葉惠瑄，黃勝，方磊

1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001；2.九芝堂股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410021

補(bǔ)腎填精口服液是由人參、鹿茸（酥）、牛鞭（酥）、狗鞭（酥）、黃芪、當(dāng)歸、肉蓯蓉、陽(yáng)起石（煅）、枸杞子、杜仲、黑順片、菟絲子、熟地黃、淫羊藿、韭菜子等15 味藥材組成的中藥制劑。臨床上用于腎陽(yáng)虧虛，腰膝痿軟或冷痛，手足不溫，陽(yáng)事不舉，精冷，精神萎靡或乏力等。

補(bǔ)腎填精口服液的處方中含有礦物藥——陽(yáng)起石，陽(yáng)起石是深色玉石的成分之一。質(zhì)地細(xì)膩的陽(yáng)起石可以作為觀賞石。纖維狀的可用作工業(yè)石棉。而塊狀、致密的陽(yáng)起石被中醫(yī)認(rèn)為性溫咸，有溫腎壯陽(yáng)的功效，用來(lái)治療陽(yáng)痿、遺精、早泄等癥狀。這也是其中文名字的由來(lái)。陽(yáng)起石首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是一種溫補(bǔ)無(wú)毒的藥材，其主要用于治療寒熱，腹痛，無(wú)子，陽(yáng)痿不起等癥［1］。其主要成分為含水硅酸鎂鈣［Ca2Mg5(Si4O11)2(OH)2］，是一種硅酸鹽類的閃石族透閃石［2］。補(bǔ)腎填精口服液中使用的是煅陽(yáng)起石，在其炮制方法中較為常用［3］，經(jīng)此處理后其溫腎補(bǔ)陽(yáng)的作用能夠得到加強(qiáng)［4-5］。

雖然在歷代主流的本草文獻(xiàn)中認(rèn)為陽(yáng)起石無(wú)毒，但古人對(duì)于礦物類藥材持謹(jǐn)慎態(tài)度，因?yàn)榈V物藥主要是由多種無(wú)機(jī)元素組成，其獨(dú)特的形成過(guò)程，容易受到有毒有害元素的污染［6-7］，導(dǎo)致有學(xué)者認(rèn)為其不宜入藥［8-9］，因此建立含礦物藥中成藥的多元素分析是很有必要的。目前對(duì)于無(wú)機(jī)元素的測(cè)定方法有許多，如原子吸收光譜法［10］、原子熒光光譜法［11］、X 射線衍射法［2,12］、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法［13］和電感耦合等離子體質(zhì)譜法［14-15］。其中電感耦合等離子體質(zhì)譜法因具有檢測(cè)限低，線性范圍寬，準(zhǔn)確快速等特點(diǎn)，已被廣泛用于多種中藥的無(wú)機(jī)元素分析中［14-18］。本試驗(yàn)采用微波消解作為前處理方法，建立ICP-MS 對(duì)補(bǔ)腎填精口服液中30 種無(wú)機(jī)元素的測(cè)定方法，并且采用聚類分析法和主成分分析法（PCA）對(duì)無(wú)機(jī)元素進(jìn)行分析，從無(wú)機(jī)元素層面對(duì)該中成藥的質(zhì)量穩(wěn)定性和安全性進(jìn)行評(píng)估。

1 材料

1.1 儀器

MARS6 微波消解儀（美國(guó)CEM 有限公司）；AE240 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；VB24UP 型恒溫加熱器（天津天大天發(fā)有限公司），iCAP-Q 型ICP-MS 分析儀（美國(guó)賽默飛有限公司）；GenPure UV-TOC/UF 型超純水（美國(guó)賽默飛科技有限公司）。

1.2 試藥

砷（As）、鋇（Ba）、鈹（Be）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鉻（Cr）、銫（Cs）、銅（Cu）、鋰（Li）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鉛（Pb）、銣（Rb）、鍶（Sr）、鉈（Tl）、釩（V）、鑭（La）、鈰（Ce）、鐠（Pr）、釹（Nd）、釤（Sm）、銪（Eu）、釓（Gd）、鋱（Tb）、鏑（Dy）、鈥（Ho）、鉺（Er）、鐿（Yb）、釔（Y）等混標(biāo)濃度為100 μg/mL；汞（Hg）、銠（Rh）、錸（Re）等單標(biāo)濃度為1 mg/mL；所有元素均購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。MOS 級(jí)硝酸購(gòu)于北京化學(xué)試劑所有限責(zé)任公司；補(bǔ)腎填精口服液均由九芝堂股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS 儀工作參數(shù)

使用調(diào)諧液對(duì)ICP-MS 的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)諧，其中射頻功率為1.45 kW，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為45.0 r/min，冷卻氣體流速為12 L/min，輔助氣體流速為0.8 L/min，霧化氣流速為0.75 L/min，霧化室溫度為2.7 ℃，各元素的積分時(shí)間為0.2 s，采集模式為動(dòng)能歧視模式，采集次數(shù)為3 次。測(cè)試時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行，其中7Li、9Be、51V、52Cr、55Mn、59Co、60Ni、63Cu、75As、85Rb、88Sr、89Y、114Cd 以103Rh 作為內(nèi)標(biāo)，133Cs、137Ba、202Hg、205Tl、208Pb、139La、140Ce、141Pr、146Nd、147Sm、153Eu、157Gd、159Tb、163Dy、165Ho、166Er、172Yb 以186Re 為內(nèi)標(biāo)。

2.2 微波消解條件

采用程序升溫進(jìn)行消解，具體參數(shù)如表1 所示。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備各精密量取一定量體積的29 種元素混標(biāo)溶液和Hg 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2%HNO3制成濃度為1 000 ng/mL 的29 種元素和100 ng/mL 的Hg 元素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按需求進(jìn)行逐級(jí)稀釋。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密吸取一定體積的Rh 和Re 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成濃度為200 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備精密量取樣品溶液1 mL，置于聚四氟乙烯的密閉消解罐中，再加入6 mL硝酸，混勻，預(yù)消解放置過(guò)夜，放入微波消解儀中按照“2.2”項(xiàng)下的程序進(jìn)行消解。消解完成后，冷卻至室溫，再緩慢擰開(kāi)消解罐蓋子，將消解罐置于110 ℃的消解罐中，使得硝酸揮干至約1 mL 后轉(zhuǎn)移至50 mL的量瓶中，將消解罐用純化水洗滌3 次，洗滌液合并至量瓶中，然后用純化水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。同法制成試劑空白。

2.4 線性關(guān)系考察

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)備液，用2% HNO3進(jìn)行稀釋，配置成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，以待測(cè)元素與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將空白溶液連續(xù)進(jìn)樣11 次，根據(jù)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生的響應(yīng)值的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為對(duì)應(yīng)元素的檢出限，其相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 30種無(wú)機(jī)元素線性關(guān)系及檢出限

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)測(cè)定6 次，記錄測(cè)得值，通過(guò)計(jì)算得到各元素的RSD 為0.21%～3.42%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取樣品1 mL，按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行樣品制備，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄試驗(yàn)值，計(jì)算得到各元素的RSD 為1.24%～3.11%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一批次樣品1 mL，共6 份，按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行樣品制備，將樣品置于室溫下，每隔1 小時(shí)按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)6 h，計(jì)算得到各元素的RSD 為0.54%～2.41%，表明供試品溶液，在室溫條件下6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取同一批次樣品0.5 mL，精密加入0.5 mL濃度為2 μg/mL（其中汞濃度為0.2 μg/mL）的混標(biāo)溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行樣品制備，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果，計(jì)算得到各元素的平均回收率為89.22%～108.51%，RSD為1.32%～3.09%。

2.9 樣品的測(cè)定

將廠家提供的11 批次樣品，按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行樣品制備，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3 中的數(shù)據(jù)可知，11 批次補(bǔ)腎填精口服液中30 種無(wú)機(jī)元素的含量差異很大，其中Mn、Rb、Sr 和Ba 這四種元素含量較高，約占30 種元素總量的85%以上。而《中國(guó)藥典》2020 年版對(duì)中藥材中重金屬及有害元素的限量標(biāo)準(zhǔn)為［19］：砷不得過(guò)2 mg/kg、鉛不得過(guò)5 mg/kg、汞不得過(guò)0.2 mg/kg、鎘不得過(guò)1 mg/kg、銅不得過(guò)20 mg/kg。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知11 批次補(bǔ)腎填精口服液樣品中重金屬及有害元素的含量均在安全限度范圍內(nèi)。

表3 不同批次樣品中無(wú)機(jī)元素的測(cè)定結(jié)果 mg/L

2.10 數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)分析

2.10.1 單因子污染指數(shù)分析目前，《中國(guó)藥典》2020 年版僅對(duì)中藥材中砷、鉛、汞、鎘、銅等5 種金屬及有害元素進(jìn)行限量，因此，采用單因子污染指數(shù)法對(duì)補(bǔ)腎填精口服液中重金屬污染情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如下。

式中：PI為各元素的污染指數(shù)；Ci為5 種重金屬的實(shí)測(cè)濃度，mg/kg；Si為5 種重金屬的限量值，mg/kg。參照《中國(guó)藥典》2020 年版中的要求，單因子污染指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別為：正常值PI＜0.2，輕微污染0.2≤PI＜0.6，中度污染 0.6≤PI＜1.0，重污染PI≥1.0，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，11 批次樣品中僅批號(hào)為20200701 的樣品中Hg 受到輕微污染，其他元素及樣品批次污染風(fēng)險(xiǎn)低。

表4 重金屬單因子污染指數(shù)

2.10.2 聚類分析采用SPSS22.0 對(duì)補(bǔ)腎填精口服液中30 種無(wú)機(jī)元素的含量進(jìn)行聚類分析。以平方歐式距離為標(biāo)準(zhǔn)，組間連接為連接方式，分析結(jié)果見(jiàn)圖1，當(dāng)類間距為20 時(shí)，可分為2 類，第一類為批號(hào)20200701、20200702，剩下的為一類；當(dāng)類間距為15 時(shí)，可分為3 類，第一類為批號(hào)20200701、20200702，第二類為批號(hào)20200904、20200905，剩余的為另一類；當(dāng)類間距為10 時(shí)，可分為4 類，第一類為批號(hào)20200701、20200702，第二類為批號(hào)20200904、20200905，第三類為批號(hào)20201002、20201203、20 201004；第四類為批號(hào)20210201、20210401、20210501、20210502。由此可知，聚類結(jié)果與補(bǔ)腎填精口服液的生產(chǎn)批次有一定相關(guān)性。這種結(jié)果的產(chǎn)生是因?yàn)樵卩徑a(chǎn)日期，原材料的投料可能為同一批次，說(shuō)明原材料具有一定的批間差異。

圖1 不同批號(hào)補(bǔ)腎填精口服液無(wú)機(jī)元素含量的聚類分析（使用平均連結(jié)的樹(shù)狀圖）

3 討論

本研究采用微波消解作為前處理方式，建立了ICP-MS 法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)腎填精口服液中30 種無(wú)機(jī)元素的方法。本樣品雖為液體制劑，但顏色較深，且偶見(jiàn)久置后瓶底有少許沉淀，因此不能將樣品直接稀釋后進(jìn)行測(cè)定，需將樣品先在室溫下預(yù)消解過(guò)夜，再采用微波消解進(jìn)行消解，防止發(fā)生“爆罐”的情況，避免設(shè)備的損壞。對(duì)所建立的測(cè)定方法進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證，線性方程相關(guān)性良好，靈敏度高，干擾小。

補(bǔ)腎填精口服液中無(wú)機(jī)元素含量可以將不同生產(chǎn)批號(hào)的樣品進(jìn)行區(qū)分，這在某種程度上也能很好地說(shuō)明樣品間的穩(wěn)定性。此外，補(bǔ)腎填精口服液中無(wú)機(jī)元素水平含量較高的是Mn、Rb、Sr 和Ba 這四種元素，而對(duì)于《中國(guó)藥典》2020 年版中有規(guī)定的5 種重金屬及有害元素——砷、鉛、汞、鎘、銅，樣品中含量均遠(yuǎn)低于限量值，其安全性還是較高的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了補(bǔ)腎填精口服液中30種無(wú)機(jī)元素的ICP-MS 測(cè)定方法。通過(guò)單因子污染指數(shù)和聚類分析對(duì)生產(chǎn)批次間的安全性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，為中藥中無(wú)機(jī)元素的含量與生產(chǎn)穩(wěn)定性的評(píng)估提供了一種思路，同時(shí)為該藥的質(zhì)量控制提供了一定參考。