補(bǔ)體經(jīng)典途徑在淚腺良性淋巴上皮病變發(fā)生中的作用

靳雨月，柳 睿，李 靜，陳圓圓，馬倩南，馬建民，丁 怡

0 引言

淚腺良性淋巴上皮病變(lacrimal gland benign lymphoepithelial lesions，LGBLEL)是一種慢性炎性病變，主要臨床表現(xiàn)為雙側(cè)淚腺無痛性腫大伴眼瞼腫脹[1-2]。近年來，醫(yī)學(xué)上對“IgG4相關(guān)性疾病”(immunoglobulin G4-related disease，IgG4-RD)概念的認(rèn)識逐漸深入，部分學(xué)者關(guān)注到IgG4表達(dá)水平與LGBLEL發(fā)病機(jī)制有關(guān)，且LGBLEL的病理學(xué)表現(xiàn)和IgG4相關(guān)性眼病(immunoglobulin G4-related ophthalmic disease，IgG4-ROD)具有相似性，均表現(xiàn)為病變組織中淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞彌漫性浸潤、纖維組織增生等，因此認(rèn)為IgG4陽性表達(dá)的LGBLEL屬于IgG4-RD的范疇[3-4]。

補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system，CS)是先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其在各種疾病中起著重要作用，如炎癥、自身免疫性疾病和免疫缺陷性疾病等，被認(rèn)為是無菌性慢性炎性病變的關(guān)鍵因素[5-6]。根據(jù)激活物的不同，CS的激活途徑可分為經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑(MBL途徑)和旁路途徑三種[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CS和IgG4-RD的發(fā)生有關(guān)。IgG可通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體C3，并啟動擴(kuò)增和激活下游補(bǔ)體C5～C9；IgG4可通過旁路途徑直接激活補(bǔ)體C3，再依次激活下游補(bǔ)體C5～C9，最終發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8-9]。經(jīng)典途徑的激活需要C1q的參與，而三種途徑激活后均需要C3及C5～C9的參與[10]。

目前關(guān)于CS和LGBLEL的相關(guān)研究較少，二者是否存在關(guān)聯(lián)，以及存在怎樣的關(guān)聯(lián)仍在探索中。Li等[11]通過轉(zhuǎn)錄組測序分析了CS在LGBLEL發(fā)病機(jī)制中的作用，初步揭示了CS與LGBLEL發(fā)病之間可能存在的關(guān)系。本研究先采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對LGBLEL的病變淚腺標(biāo)本進(jìn)行檢測，并在此基礎(chǔ)上使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫組織化學(xué)染色和Western Blotting檢測等方法進(jìn)一步驗證，探討CS及其經(jīng)典途徑在LGBLEL發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1材料采集2010-07/2013-10于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確診斷的LGBLEL患者6例(LGBLEL組)和眼眶海綿狀血管瘤(cavernous hemangioma，CH)患者6例(CH組)的病變組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其中LGBLEL患者男女性別構(gòu)成比為1∶5，年齡28～64(中位數(shù)38.5)歲；CH患者男女性別構(gòu)成比為1∶2，年齡31～55(中位數(shù)51.5)歲。另采集2018-10/2019-08于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確診斷的LGBLEL患者4例和眼眶CH患者3例的病變組織標(biāo)本進(jìn)行驗證實驗，其中LGBLEL患者男女性別構(gòu)成比為1∶3，年齡45～50(中位數(shù)46.0)歲；眼眶CH患者男女性別構(gòu)成比為2∶1，年齡45～53(中位數(shù)48.0)歲。本研究獲得倫理委員會審核批準(zhǔn)(No.TRECKY2013-KS-05)，所有患者完全理解本研究的目的，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1病變組織標(biāo)本采集LGBLEL和眼眶CH的病變組織標(biāo)本由臨床醫(yī)師在術(shù)中進(jìn)行采集，迅速轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)化實驗室處理備用。病變組織標(biāo)本一部分冷凍保存?zhèn)溆茫硪徊糠纸萦?0%福爾馬林用于石蠟包埋和切片。

1.2.2蛋白質(zhì)組學(xué)分析RIPA法提取組織中蛋白質(zhì)，檢測蛋白質(zhì)濃度、總量和均一性，質(zhì)檢合格后使用Q Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Scientific公司)進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定和蛋白定量。實驗過程具體按照TMT? Mass Tagging Kits and Reagents試劑盒(Pierce公司)和iTRAQTMReagents試劑盒(AB Sciex公司)說明書進(jìn)行樣品處理和標(biāo)記，混合標(biāo)記后的樣品用于C18柱分級。將樣品充分溶解后上樣到液質(zhì)聯(lián)用儀，進(jìn)行二級質(zhì)譜測序，生成原始文件并進(jìn)行分析。

1.2.3RT-PCR檢測剪碎組織加入裂解液，提取RNA。設(shè)計PCR引物，按照PCR試劑盒(AQ131-01；全式金)說明書進(jìn)行操作，采用反轉(zhuǎn)錄法合成總RNA的cDNA，并將其作為模板進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)條件為：95℃/3min；95℃/30s；55℃/20s；72℃/20s；40個循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4免疫組織化學(xué)染色組織切片常規(guī)脫蠟入水，H2O2室溫孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶，4℃條件下一抗(1∶100)孵育過夜，37℃二抗孵育30min，DAB染色，蘇木精染色，封片，顯微鏡下觀察。CS信號通路相關(guān)蛋白一抗：C3(DF13224；Affinity Biosciences)、C5(DF7719；Affinity Biosciences)、C9(DF3964；Affinity Biosciences)、C1qA(ab76425；Abcam)。

1.2.5WesternBlotting檢測組織加入裂解液后離心，提取蛋白并測定濃度。制備電泳凝膠，將蛋白樣品與5×loading buffer混合后于100℃處理5min，每孔上樣100μg總蛋白，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體(一抗工作濃度：1∶500)孵育，最后使用ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行免疫印跡顯色。CS信號通路相關(guān)蛋白一抗：C3(DF13224；Affinity Biosciences)、C5(DF7719；Affinity Biosciences)、C9(DF3964；Affinity Biosciences)、C1qA(ab76425；Abcam)。

統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS 25.0軟件和Graphpad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖。計量資料的組間差異比較采用獨立樣本t檢驗(其中CH患者病變組織中C3 mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果不符合正態(tài)分布，采用Mann-WhitneyU檢驗進(jìn)行分析)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1蛋白質(zhì)組學(xué)分析差異性蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，相對于眼眶CH患者，LGBLEL患者病變淚腺組織中CS信號通路重要蛋白C3、C5、C9、C1q等表達(dá)均發(fā)生改變(圖1)，提示CS信號通路在LGBLEL組織中表達(dá)具有差異。

圖1 CS信號通路及相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá) 綠色代表上調(diào)蛋白；紫色代表下調(diào)蛋白。

2.2RT-PCR檢測CS信號通路相關(guān)基因的表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果表明，與眼眶CH患者相比，LGBLEL患者病變淚腺組織中CS信號通路重要基因C1qA(t=-21.966，P<0.001)、C5(t=-6.013，P=0.002)和C9(t=-6.102，P=0.009)mRNA表達(dá)水平均明顯升高，而C3 mRNA雖然也表現(xiàn)出了升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.057)，見圖2。

圖2 CS信號通路重要基因表達(dá)水平 A：C1qA；B：C3；C：C5；D：C9。bP<0.01 vs CH。

2.3免疫組織化學(xué)染色檢測CS信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，LGBLEL患者病變淚腺組織中C1qA、C3、C5和C9染色呈棕黃色，表達(dá)水平明顯高于眼眶CH患者(圖3)。

2.4WesternBlotting檢測CS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)Western Blotting檢測結(jié)果表明，與眼眶CH患者相比，LGBLEL患者病變淚腺組織中C1qA(t=-7.232，P=0.001)、C3(t=-2.843，P=0.036)、C9(t=-4.324，P=0.008)蛋白表達(dá)水平均明顯升高，C5也表現(xiàn)出升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.383，P=0.063)，見圖4。

圖4 Western Blotting檢測CS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) A：Western Blotting檢測結(jié)果；B：Western Blotting檢測結(jié)果量化分析。aP<0.05, bP<0.01 vs LGBLEL。

3 討論

LGBLEL被認(rèn)為屬于IgG4-RD的范疇，而IgG、IgG4在補(bǔ)體激活過程中具有重要作用[8]。Sugimoto等[12]研究發(fā)現(xiàn)IgG4可能參與IgG4-RD低補(bǔ)體血癥患者補(bǔ)體的激活。Muraki等[13]報道36%的IgG4相關(guān)性自身免疫性胰腺炎患者血清補(bǔ)體C3和C4減少，提示補(bǔ)體激活系統(tǒng)參與了IgG4相關(guān)性自身免疫性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制。另有研究報道IgG4-RD中C5a顯著增加，并建議將其作為治療靶點，但此結(jié)論存在爭議[14-15]。Breville等[16]報道了1例罕見的補(bǔ)體介導(dǎo)的繼發(fā)于IgG4-RD的血管微血栓疾病患者，提示IgG4自身抗體具有誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的血管性微血栓形成作用。Montaez等[17]研究顯示IgG免疫復(fù)合物可以引起補(bǔ)體C3a、C5a和C5b-9的釋放。上述研究表明，CS的激活參與IgG4-RD的發(fā)生機(jī)制，這為CS與LGBLEL直接關(guān)聯(lián)提供了研究基礎(chǔ)。

經(jīng)典途徑是CS發(fā)揮作用的途徑之一，C1q是CS經(jīng)典途徑重要的組成成分。C1q由C1qA、C1qB、C1qC等亞基組成[18]，激活物與C1q結(jié)合激活經(jīng)典途徑，C3、C5、C9則是補(bǔ)體活化過程中，在三種補(bǔ)體通路中均發(fā)揮作用的重要組成成分[10]。已有研究顯示，CS的相關(guān)基因和蛋白在LGBLEL組織中均發(fā)生了明顯改變，這表明CS可能參與LGBLEL的發(fā)病機(jī)制，并且其經(jīng)典途徑可能參與了該過程。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠反映特定狀態(tài)下的蛋白質(zhì)圖譜，直接顯示蛋白質(zhì)豐度或狀態(tài)，是監(jiān)測疾病蛋白質(zhì)變化、探索疾病發(fā)生機(jī)理的常用方式之一[19-20]。作為近年來常見的檢測技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高效、快捷、全面等優(yōu)點，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，能夠?qū)膊〗M織中發(fā)生變化的蛋白質(zhì)有初步的較為全面的了解，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對表達(dá)異常的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗證，能夠更快更準(zhǔn)確地鎖定與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，為了解疾病的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測LGBLEL的病變淚腺標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)C1q、C3、C5、C9等補(bǔ)體相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)生了改變，提示CS可能參與LGBLEL的發(fā)病機(jī)制。通過RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色和Western Blotting法在蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上對這些蛋白的改變進(jìn)行驗證，進(jìn)一步探討CS在LGBLEL發(fā)病機(jī)制中可能的作用。研究結(jié)果顯示，與眼眶CH患者相比，LGBLEL患者病變淚腺組織中C1qA(P<0.001)、C5(P=0.002)、C9(P=0.009)mRNA表達(dá)升高，C1qA(P=0.001)、C3(P=0.036)、C9(P=0.008)蛋白表達(dá)水平明顯升高；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與眼眶CH患者相比，LGBLEL患者病變淚腺組織中C1qA、C3、C5、C9染色明顯增多。但可能由于樣本量偏小的原因，雖然在LGBLEL患者病變淚腺組織中，C3 mRNA和C5蛋白水平檢測表現(xiàn)出了升高的趨勢，但差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，C1qA的變化趨勢與前期已有研究存在一致性[11]，但與蛋白組學(xué)的結(jié)果存在差異，分析可能是由于蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果檢測范圍過大存在誤差所致。總之，本研究結(jié)果提示，CS參與LGBLEL的發(fā)病機(jī)制，且其經(jīng)典途徑可能是其發(fā)揮作用的途徑之一。

LGBLEL屬于IgG4-RD，而IgG4在補(bǔ)體激活過程中具有重要作用，表明IgG4可能通過激活CS在LGBLEL中發(fā)揮作用。目前關(guān)于CS在IgG4-RD中的作用仍然存在爭議[21]。IgG4不能與C1q相結(jié)合，因此被認(rèn)為不能激活經(jīng)典途徑，但最近有研究提到，雖然IgG4不能直接與C1q相結(jié)合，但是可能影響其他類型IgG與C1q的結(jié)合[22-23]。此外，IgG4還能夠激活旁途徑參與補(bǔ)體途徑的調(diào)控，但由于時間等因素的局限本研究并未對此進(jìn)行深入研究。由于正常淚腺組織難以獲得，故根據(jù)前期研究[11]本研究選擇眼眶CH患者的病變組織作為對照進(jìn)行研究。總之，本研究在蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上驗證了CS參與LGBLEL發(fā)病機(jī)制的過程，并進(jìn)一步提出經(jīng)典途徑可能在該過程中發(fā)揮作用。