基于網絡藥理學研究二仙湯加減方治療脊髓損傷的作用機制

李二亮 晏榮保 閆 康 趙寧俠 黃汝芹 馬 瓊 趙海恩 廖 博

(1 空軍軍醫大學第二附屬醫院骨科，西安，710038；2 空軍軍醫大學第二附屬醫院中醫科，西安，710038)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)指由各種原因導致椎管內神經結構(包括脊髓和神經根)及其功能的損害，出現損傷水平及以下脊髓功能(運動、感覺、反射等)障礙，是脊柱骨折的嚴重并發癥[1]。脊髓損傷根據不同的損傷平面會出現相應的神經功能障礙，如呼吸肌麻痹，大小便失禁等癥狀，嚴重者可引起不同程度的截癱，甚至會危及生命[2]。相關研究顯示，我國SCI年患病率為37/100萬，年齡34.7～54.4歲，男性高于女性，汽車碰撞和高空墜落是SCI的主要原因[3]。盡管創傷性SCI患者的生存率隨著時間的推移而改善，但患者的病死率仍然超過年齡匹配的對照組[4]。目前關于創傷性脊髓損傷的治療主要包括早期手術治療、高壓氧治療、針灸治療、中國傳統藥物治療等[5-11]。

二仙湯由仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、黃柏、知母組成，是20世紀50年代初張伯納研制的著名中藥方劑，用于治療骨質疏松癥已有幾十年的歷史[12]。桃紅四物湯主要由6味中藥組成，包括桃仁、紅花、當歸、川芎、白芍、熟地黃，記載于中國清代吳謙的《醫宗金鑒》，用于促進血流，防止瘀血的發生，也已廣泛應用于骨關節炎的治療[13-14]。我院總結長期臨床經驗，在傳統中藥制劑二仙湯以及桃紅四物湯的基礎上進行適當的加減，增加了黃芪、延胡索、郁金、香附、陳皮、山藥、丹參，構建二仙湯加減中藥方劑用于臨床治療SCI。該方由18味中藥組成：仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、黃柏、知母、桃仁、紅花、熟地黃、白芍、川芎、黃芪、延胡索、郁金、香附、陳皮、山藥、丹參。見表1。雖然二仙湯加減目前已應用于促進脊髓損傷患者術后功能恢復等方面，然而該方在脊髓損傷術后治療中的作用機制尚不明確。

中藥網絡藥理學通過網絡生物學、化學信息學、藥理學和生物信息學等多學科交叉，從整體視角出發，發現藥物和機體的復雜相互作用，為中藥復方作用機制的研究提供了有效工具和新的視角[15]。本研究結合網絡藥理學和實驗研究，探究二仙湯加減治療脊髓損傷的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級Wistar雌性大鼠(斯貝福生物技術有限公司，合格證編號：No.110324200104595445)，動物房保持12 h/12 h晝夜交替，保持動物自由飲水、進食，溫度23～25 ℃，濕度62%，適應性飼養1周后進入實驗。

1.1.2 藥物 二仙湯加減藥物組成為：仙茅10 g、淫羊藿30 g、巴戟天10 g、當歸10 g、黃柏12 g、知母10 g、桃仁10 g、紅花10 g、熟地黃24 g、白芍30 g、川芎9 g、黃芪40 g、延胡索15 g、郁金12 g、香附12 g、陳皮10 g、山藥20 g、丹參9 g。中藥方劑來源于本院中醫科(華潤三九配方顆粒，批號：2101004S)；戊巴比妥鈉(默克公司，德國，批號：P11012)，5%復方利多卡因乳膏(同方藥業集團有限公司，批號：2012122)，注射用頭孢唑林鈉(四川制藥制劑有限公司，批號：210101B)。

1.1.3 試劑與設備 4%通用型組織固定液(中性)(中暉赫彩生物醫藥科技公司，批號：BA1102)；氯化鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司，批號：2107032831)；脊髓損傷模型打擊器(北京金源科創科技有限公司，型號：ZH-ZYQ)；4-0縫線(強生醫療器材有限公司，批號：21454605)。

1.2 方法

1.2.1 SCI模型制備 使用戊巴比妥鈉腹腔麻醉8周SPF級Wistar雌性大鼠，在胸椎節段(T9)進行椎板切除術，直至脊髓從一側到另一側完全暴露，利用脊髓損傷模型打擊器參照Allens法從50 mm高度進行脊髓打擊，形成損傷組(50 mm損傷)，假手術組僅進行椎板切除而不進行脊髓打擊，術后用4-0縫線分層縫合肌肉和皮膚，術后皮下給予注射用頭孢唑林鈉2 mL、5%復方利多卡因乳膏鎮痛以及保溫處理，如有膀胱功能障礙，每天行膀胱排空1次，直至恢復膀胱功能(圖1A-F)。

圖1 動物實驗相關操作過程

脊髓損傷造模成功的標準：實驗動物出現擺尾反射、雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓[21]。造模后對所有實驗動物進行評分，損傷動物Basso、Beattie和 Bresnahan(BBB)運動評定量表評分≤2的實驗動物被選用[22]。

1.2.2 分組和干預 將實驗動物分為3組，中藥組(50 mm損傷+藥物)，對照組(50 mm損傷+水)，假手術組。中藥組給予大鼠常規灌胃約2 mL(3 g合劑)二仙湯加減藥液，對照組給予大鼠常規灌胃2 mL生理鹽水，假手術組不做任何處理。

1.2.3 行為學評價及蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色 為評估SCI后肢功能行為學，通過BBB運動評定量表對大鼠進行評價，該量表用于評估關節運動、行走能力、軀干穩定性、肢體協調性、尾部位置和爪的精細運動。評分范圍為21～0，分別表示運動正常和完全癱瘓。由兩名分組設盲并接受充分培訓的研究者對實驗動物SCI前后進行BBB運動評定量表評分。如果2名研究者的評分不一致，則通過討論確定共識評分。

HE染色：取脊髓損傷后第7天大鼠脊髓組織標本按標準HE染色技術處理。具體方法：用4%通用型組織固定液(中性)固定脊髓組織，在乙醇中脫水，然后包埋。隨后對脊髓切片(3 μm)并進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察病理學改變。

1.2.4 構建二仙湯加減中藥-中醫癥狀-現代醫學癥狀網絡圖 通過SymMap(https://www.symmap.org/)在線數據庫獲得二仙湯加減中藥成分以及對應的中醫癥狀、現代醫學癥狀，構建網絡圖[17]。

1.2.5 中藥成分挖掘 將二仙湯加減的18味中藥材在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中進行挖掘，收集中藥成分。以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為標準進行相關成分篩選，得到中藥活性成分集合[16]。

1.2.6 成分靶標篩選 活性成分進一步在TCMSP中挖掘其對應靶標，將篩選的靶標成分與Uniprot(https://www.uniprot.org)數據庫數據進行匹配，獲得靶標基因。

1.2.7 SCI靶標基因篩選 分別以關鍵詞“SCI”“Spine Cord Injure”“spine cord injure”在Genecards(https://www.genecards.org)，DrugBank(https://go.drugbank.com/)在線數據庫檢索相關基因，將獲得的數據匯總后去重，得到SCI靶標基因。

1.2.8 構建藥物疾病韋恩圖 獲得二仙湯加減中藥靶標與SCI基因后，取二者的交集靶標基因，繪制韋恩圖。

1.2.9 構建藥物疾病交集靶標基因蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡 將二仙湯加減方與SCI的交集靶標基因輸入到STRING在線數據庫(https://string-db.org/)的Multiple proteins選項，Network type設置為full network，minimum required interaction score設置為medium confidence(0.400),得到PPI網絡信息，再導入Cytoscape 3.7.1軟件將PPI網絡進行可視化處理。

1.2.10 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將二仙湯加減與SCI的交集靶標基因輸入到Metascape在線數據庫(http://metascape.org/gp/index)，設定Min Overlap：3，P Value Cutoff：0.01，Min Enrichment：1.5.分別選擇GO相關的數據庫以及KEGG通路數據庫，篩選相關數據導入生信云平臺(http://www.ehbio.com)繪制氣泡圖。

2 結果

2.1 有效作用靶點篩選 二仙湯加減中藥-中醫癥狀-現代醫學癥狀網絡圖表明18味中藥與SCI相關的中醫癥狀共有21個，對應的現代醫學癥狀為26個，其中相關性最高的前5個中藥分別為川芎、當歸、香附、丹參、延胡索；中醫癥狀和現代醫學癥狀前10個為痛、腫痛、脹痛、跌撲腫痛、腰膝酸軟、疼痛、牽扯痛、放射痛、灼燒痛、壓迫痛。見圖2。

圖2 二仙湯加減方中藥-中醫癥狀-現代醫學癥狀網絡

2.2 動物實驗結果 假手術組大鼠術后不同時間段BBB運動評定量表評分均為21分，說明單純椎板開窗，對脊髓并未造成損傷。對照組大鼠在術后0 h至7 d出現雙下肢完全癱瘓，BBB運動評定量表評分為0分，顯示大鼠脊髓損傷并且在7 d內自愈效果較差；而中藥組在0～24 h下肢完全癱瘓，BBB運動評定量表評分為0分和對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。隨著時間的推移(24 h至7 d)，中藥組在大鼠可見明顯逐漸恢復，在SCI后7 d時中藥組BBB運動評定量表評分與對照組比較，差異有統計學意義(P=0.019 8)。見圖3。

圖3 各組大鼠術前及術后BBB運動評定量表評分

HE染色結果顯示，假手術組見正常大鼠脊髓組織(圖4A)，對照組可見脊髓組織出現大片空洞(圖中藍色箭頭所指)(圖4B)，中藥組可見脊髓組織大片空洞明顯縮小(圖中藍色箭頭所指)(圖4C)，正常脊髓組織替代原有損傷區域。

圖4 各組大鼠術后脊髓組織(HE染色，×40)

2.3 二仙湯加減方效應成分集構建 共檢索到5 353個基因，去重篩選后共獲得319個基因。

2.4 二仙湯加減治療SCI效應成分靶標發現 從GeneCard數據庫共檢索到3 226個基因，DrugBank數據庫共檢索11個基因，合并去重后共獲得2 638個基因，SCI與二仙湯加減交集基因216個(3.76%)。見圖5。

圖5 二仙湯加減靶標基因-脊髓損傷靶標基因韋恩圖

2.5 二仙湯加減靶標和SCI疾病基因關聯分析 結果表明，19種蛋白Degree值大于100，分別為AKT1、ALB、IL6、TP53、MAPK3、VEGFA、TNF、EGFR、CASP3、MAPK1、EGF、JUN、MAPK8、MYC、MMP9、ESR1、FOS、PTGS2、CXCL8。見圖6。

圖6 二仙湯加減-SCI蛋白靶點PPI網絡

2.6 GO分析與KEGG通路分析 GO富集共有8 912個條目，其中生物學途徑共有個6 712個條目，包括藥物反應、凋亡過程負向調控、細胞增殖正向調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正向調控、血管生成正調控等。見圖7A。633個條目與細胞組分有關，包括胞外間隙、神經元投射、線粒體外膜、受體復合物、線粒體、膜筏等。見圖7B。1 034項與分子功能相關，包括酶結合、蛋白結合、相同蛋白結合、核受體活性、藥物結合、蛋白激酶活性等。見圖7C。共納入533條信號通路，包括cAMP信號通路、PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路等。見圖7D。

圖7 各種相關富集分析

3 討論

作為哺乳動物的常見模型動物,目前脊髓損傷基礎研究領域常用的實驗動物有大鼠和小鼠。大鼠因其在體型以及可操作性上優于小鼠，所以是脊髓損傷中最常用的實驗動物。一般選擇180～220 g雌性大鼠，Allens法在大鼠的撞擊部位形成囊性空洞，并進一步引起局部炎癥反應[18-20]。在造模時，實驗動物出現擺尾反射、雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓，BBB運動評定量表評分≤2被確認脊髓損傷造模成功[21-22]。

由于中藥方劑成分的復雜性，存在一些亟待解決的問題。值得注意的是，中藥在成分靶點研究方面與西藥比較存在一定的滯后性，并且二者之間無有效的交互作用，這是中藥有效成分基礎研究和相關機制研究目前存在的問題之一。隨著網絡藥理學的發展，逐漸將公開的藥物數據與遺傳-疾病相關性、基因表達信息和PPI數據整合，從而進一步研究藥物之間的關系以及藥物與疾病之間的關系[23]。

本研究基于網絡藥理學分析了二仙湯加減中18味中藥成分的潛在蛋白靶點，以及SCI疾病的基因潛在靶點，利用4個數據庫檢索的靶標構建藥物疾病網絡圖，二仙湯加減的單一藥物成分可能作用于多個靶點，多種成分可能作用于單個靶點。具有多個靶蛋白的活性成分可能比單靶成分具有更好的臨床療效和更少的不良反應。通過GO與KEGG相關富集分析，生物學途徑主要有藥物反應、凋亡過程負向調控、細胞增殖正向調控、血管生成正調控等，參與的細胞組分主要有胞外間隙、神經元投射等，分子功能主要包括藥物結合、蛋白激酶活性、酶結合等。在cAMP等信號通路中Ryanodine受體可能參與調控。

Ryanodine受體(Ryanodine Receptors，RyRs)是肌肉、神經組織等多種可興奮組織的一類細胞內鈣通道，RyRs由3種主要亞型(RyR1、2和3)組成，通過不同的信號通路參與不同細胞內細胞器鈣的釋放[23]。既往研究認為，RyR2通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系2介導的氧化還原狀態的調節從而線粒體和內質網功能障礙及炎癥在SCI中發揮重要作用[24]。本研究進一步驗證了cAMP信號通路在SCI治療中的意義。

4 結論

基于網絡藥理學與動物實驗等方法探討二仙湯加減方在SCI治療中的作用機制，發現二仙湯加減方劑中的川芎、當歸、丹參、香附、延胡索、淫羊藿、郁金等關鍵活性成分可能通過AKT1、MAPK3、NFKBIA、FOS、PIK3CG等關鍵基因介導cAMP、PI3K/AKT、MAPK、TNF等信號通路，起到治療SCI的目的。但在動物實驗中，二仙湯加減采用顆粒包裝開水沖服的方法，是否丟失了熬藥時藥物成分之間的交互作用，無從得知，仍需要進一步研究。