基于網絡藥理學研究補腎方治療阿爾茨海默病的作用機制

姚 璇 時 晶 王 旭 倪敬年 魏明清 李 婷 田金洲

(北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一種以記憶力減退、認知功能障礙為主要臨床表現的神經退行性疾病，至今尚無理想的治療方法。目前美國食品藥品管理局批準的5種治療AD的藥物，4種是膽堿酯酶抑制劑，第5種是NMDA受體阻滯劑，它們只能短期改善癥狀，但不能延緩疾病進展[1]。AD的新藥仍在不斷研發過程中，候選藥物多針對單一靶標或單一疾病相關途徑，至今未取得突破性成果[2]。AD是一種復雜的疾病，存在多個層次相互作用(基因、蛋白、細胞器、細胞、組織、整個機體、外環境)，因此藥物-蛋白作用的網絡模型更優于線性的藥物-蛋白模型，是AD藥物研發的新思路[3-4]。

中醫認為，AD的發生與腎虛有密切關系，腎虧之年，精髓乏源，髓海失養，神機失用，發為癡呆。同時老年臟腑虛衰，生理或病理產物不能及時排除，蓄積體內，生痰生瘀，痰濁蒙殼、瘀阻腦絡，使腦氣與臟器不相連接，神機失用，便發癡呆。中藥防治AD取得一定療效，田金洲教授臨床治療AD取得一定療效，其團隊歷時24個月的研究表明，中藥聯合AD常規治療患者MMSE評分顯著優于AD常規治療[5]。其中藥方劑的核心藥物組成：人參、淫羊藿、遠志、郁金已申請通過國家專利(專利號：ZL2008100067.33.0)，命名為補腎方。補腎方治療AD的生物學基礎與分子機制尚待進一步研究。

網絡藥理學是人工智能和大數據時代背景下一門新興、交叉、前沿的學科，已被廣泛應用于中醫藥領域，其系統性及整體性的研究特點，在一定程度上解決了單靶點機制通路的研究方法難以解釋中藥多成分、多靶點協同作用的問題，使中藥藥物研發具有可預測性，為中醫從經驗醫學轉化為循證醫學提供新的范例[6-7]。據此，本研究根據世界中醫藥學會聯合會發布的Network Pharmacology Evaluation Method Guidance-Draft[8]，探討補腎方治療AD的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 補腎方主要活性化合物的篩選及作用靶點的確定 本研究依托中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和中藥分子機制生物信息學分析工具BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org)檢索人參、淫羊藿、郁金、遠志的主要活性化合物。本研究設置口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18對化合物進行篩選。利用數據庫查詢主要活性化合物的作用靶點，其中BATMAN-TCM分析平臺靶點獲取設置條件閾值(Prediction Score Cutoff)>20。隨后利用Uniprot數據庫(https://uniprot.org/)將靶蛋白名轉換為標準基因名，得到化合物對應關鍵靶點的基因。

1.2 阿爾茨海默病靶點的收集及潛在靶點預測 使用GeneCard(https://www.genecards.org/)數據庫，以“Alzheimer Diease”為關鍵詞檢索AD相關基因，該庫集成了約150個網絡來源的基因數據，每個基因名稱有AD相關證據，Score值越高則代表靶點與疾病關系越密切，根據經驗，若靶點過多，設置Score>30。使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具,將藥物預測的靶點與疾病的靶點進行映射，獲得補腎方治療AD的潛在靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡、藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡的構建 將藥物和疾病相映射得到的48個交集基因在STRING平臺進行PPI網絡分析，將數據導入Cytoscape 3.7.2得到PPI網絡，節點越大，顏色越深，表明度值越大，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用，線條越多表示關聯度越大。

將潛在靶點通過STRING數據庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)構建靶標PPI網絡。利用Cytoscape 3.7.1軟件(http://www.cytoscape.org/)構建藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡。

1.4 靶點功能富集分析 將核心靶點基因進行功能富集和主要作用通路分析，使用Metascape平臺(https://metascape.org/)，以P<0.01進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，篩選排名靠前的生物過程和通路，并對富集分析結果進行可視化處理。GO注釋分析是指通過相同的語義描述基因生物學功能的項目，包含細胞成分(Cell Components，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)和生物過程(Biological Process，BP)3部分。

2 結果

2.1 補腎方主要活性化合物及其作用靶點 按照篩選條件，得到人參化學成分22個，淫羊藿化學成分23個，郁金化學成分15個，遠志化學成分31個。刪除重復、冗雜以及未找到靶點的化合物，最終共獲得45個化合物，利用數據庫查詢主要化合物調控的靶點信息，共篩選出對應的作用靶點397個。最后通過Uniprot對靶點和基因信息進行標準化。

2.2 補腎方治療AD的潛在靶點 從GeneCards數據庫中檢索到AD的潛在靶點，根據經驗設置Score>30的靶點為AD的潛在靶點，共得到282個靶點。運用Venny 2.1在線工具，將補腎方主要活性成分調控的靶點與AD的疾病靶點取交集，最終得到交集靶點48個。見圖1。

圖1 補腎方-阿爾茨海默病靶點韋恩圖

2.3 補腎方治療AD潛在靶點PPI網絡構建 PPI網絡包含48個節點和513條邊，其中節點表示蛋白，度值表示連接到1個節點的線條數。靶蛋白平均節點度值為21.4，超過平均度值的靶點26個。AKT1、IL-6、CASP3、TNF、TP53、VEGFA、MAPK1、PTGS2、IL1B、CCL2、EGF、APP、CXCL8度值顯著高于其余靶點，在PPI網絡中起著重要的聯系作用。其中，AKT1的節點最大，顏色最深，可能是補腎方治療AD最主要的潛在靶點。見圖2。

圖2 補腎方與AD交集靶點的PPI網絡

2.4 藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡 運用Cytoscape 3.7.1軟件構建藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡，網絡包含30個化合物，48個靶點，1個疾病。紅色節點代表疾病，藍色代表靶點，橙色代表藥物名稱，淡黃色代表人參的活性成分，淡綠色代表淫羊藿的活性成分，淡紫色代表遠志的活性成分，淡藍色代表人參與淫羊藿共有的活性成分，淡粉色代表郁金與人參共有的活性成分，每條邊表示化合物和靶點之間相互作用的關系。根據節點度值等網絡拓撲學特征進行核心節點的篩選。結果顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、脫水淫羊藿素、人參皂苷等化合物在整個網絡中發揮著關鍵作用，可能是補腎方治療AD的核心化合物。見圖3。藥物、成分對應標記名稱見表1。

表1 補腎方主要成分

圖3 藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡

2.5 靶點通路分析 通過Metescape數據庫進行GO功能富集分析，得到BP條目1 077條(P<0.05)。其中，神經遞質代謝過程(Neurotransmitter metabolic process)、細胞因子介導信號通路(Cytokine-mediated signaling pathway)、對無機物的反應(Response to inorganic substance)、對脂多糖的反應(Response to lipopolysaccharide)、細胞增殖的負調節(Negative regulation of cell proliferation)、小分子代謝過程的調節(Regulation of small molecule metabolic process)、管制囊泡介導的運輸細胞遷移的積極調節(Regulation of vesicle-mediated transport)、細胞對有機循環化合物的反應(Cellular response to organic cyclic compound)、代謝過程受體(Receptor metabolic process)、細胞對氮化合物的反應(Cellular response to nitrogen compound)、細胞對藥物的反應(Cellular response to drug)、細胞對氧氣水平的反應(Response to oxygen levels)、循環系統中的血管過程(Vascular process in circulatory system)、細胞分化的負調節(Negative regulation of cell differentiation)、血管發育(Blood vessel development)、腺體發育(Gland development)、化學突觸傳播的調節(Modulation of chemical synaptic transmission)、神經元死亡(Neuron death)、細胞黏附調節(Regulation of cell adhesion)等BP中，靶點較集中。這提示補腎方活性化合物通過調控多種生物學途徑對AD產生影響。將排名前20的GO條目繪制柱狀圖。見圖4。

圖4 補腎方主要成分潛在靶點GO-BP分析

KEGG通路富集分析篩選出128條信號通路(P<0.01)，選取P值較小的16條通路(圖5)。這些基因數目在IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、結核病(Tuberculosis)、腫瘤(Pathways in cancer)、流體剪切應力與動脈硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、血清素能突觸(Serotonergic synapse)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、核因子κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、產生IgA的腸道免疫網絡(Intestinal immune network for IgA production)等通路上富集較多。將排名前16的KEGG條目繪制柱狀圖。見圖5。

圖5 補腎方主要成分潛在靶點KEGG分析

3 討論

補腎方由淫羊藿、人參、遠志、郁金4味中藥組成，將補腎、益氣、化痰、活血治法中各具代表性的中藥組成本方，具有標本兼治，扶正祛邪的作用。前期研究發現，與模型組比較，補腎方能改善AD模型鼠學習記憶行為，減輕AD病理學改變、膽堿酯酶、糖原核酶激酶3β表達水平，提高蛋白磷酸酶2A表達水平，改善突觸結構，增加腦內葡萄糖轉運、調控胰島素信號通路[9-14]。本研究采用網絡藥理學方法構建補腎方的“藥物-化合物-作用靶點-疾病”網絡，得到29個活性化合物，48個潛在靶點，188條潛在通路，進一步挖掘補腎方的潛在作用靶點，與實驗研究相互補充驗證。

本研究篩選出幾個重要成分，在活性化合物中，槲皮素綜合評分遠高于其他化合物，存在于淫羊藿中。槲皮素是一種黃酮類化合物，在神經退行性疾病中具有神經保護作用。槲皮素對AD的神經保護作用包括拮抗β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的毒性作用，一項體外研究發現，槲皮素抑制Aβ纖維聚集并破壞成熟的纖維[15]；使用槲皮素預處理過的原代海馬神經元，Aβ1-42的神經毒性作用更小[16]。槲皮素可能通過PI3K/AKT/GSK3β通路抑制Tau過度磷酸化，減輕神經病理[17]。槲皮素具有抗神經炎癥的作用，能下調衰老小鼠海馬組織炎癥介質表達水平，改善小鼠空間學習能力[18]。此外既往研究還發現槲皮素能保護神經元免受氧化應激和興奮性毒性的損害,改善膽堿能功能并在AD中起神經保護劑等作用[19-20]。山柰酚存在于人參和淫羊藿中，作為另一種黃酮類化合物，其能降低AD模型果蠅氧化應激水平和乙酰膽堿酯酶活性，可能對AD治療有一定作用[21]。木犀草素是一種植物雌激素，研究發現，木犀草素對Aβ25-35損傷PC12細胞具有保護作用[22]。

將補腎方主要活性成分調控的靶點與AD的治療靶點取交集，得到48個關鍵靶點，其中AKT1度值最大，可能是補腎方治療AD最主要的潛在靶點。AKT1基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1，在蛋白質合成通路、細胞凋亡過程中起關鍵作用。AKT1中的rs2498786啟動子多態性與患有2型糖尿病及不患有2型糖尿病的中國漢族人群AD發病風險有關[23]。AKT1參與特定區域(AT100表位)的tau磷酸化[24]。AKT通過介導的信號通路AKT/GSK3β在AD發病中發揮作用[25]。既往研究發現補腎方中的成分可能通過作用于AKT1，調節其下游蛋白糖原合酶激酶3(Glycogen Synthase Kinase-3，GSK-3)，從而抑制Aβ沉積及神經纖維纏節的形成，從疾病通路的上游進行干預，保護神經元免于凋亡[26-27]。

GO功能富集分析得到生物過程GO條目1 077個(P<0.01)，KEGG通路富集分析篩選得到128條信號通路(P<0.01)。GO富集分析涉及神經遞質代謝過程、細胞因子介導信號通路、循環系統中的血管過程、化學突觸傳播的調節、神經元死亡等生物過程。

KEGG通路富集分析顯示，潛在靶點主要參與的流體剪切應力與動脈硬化通路、胰島素抵抗通路等，與現有的AD發病機制報道相吻合。近年來研究發現，胰島素可從外周穿越血腦屏障，介導神經遞質在突觸間傳遞，調節神經元和神經膠質細胞代謝，以及大腦中的神經炎癥反應[28]。因此，作用于胰島素抵抗通路是防治AD的新策略。研究表明，鼻內胰島素給藥可改善2型糖尿病患者、肥胖患者或健康人群的記憶力及其他認知功能。補腎方中的成分可能作用于胰島素抵抗通路防治AD[29-31]。

動脈粥樣硬化是一種慢性綜合征，會影響血管(包括腦血管)結構和功能的完整性，從而導致腦血管功能障礙[32]。研究發現，在Aβ沉積、tau過度磷酸化、神經元損傷這些AD經典的病理特征出現之前，AD早期就出現神經血管功能障礙[33]。由于神經血管功能紊亂，腦血流對神經活動調節受損，從而導致神經活動與所需要的氧氣和葡萄糖供應不相匹配，因此腦功能受損，臨床表現為認知功能下降。補腎方可能通過流體剪切應力與動脈硬化通路調節腦血流量，保護腦血管，從而對疾病的早期進行干預。

另外，其他通路也發揮著重要作用，例如HIF-1信號通路參與調解AD病情中的氧化應激及線粒體功能障礙[34]。血清素能突觸通路參與學習、記憶、情緒、睡眠等多個生理過程，與AD密切相關[35]。

以上分析了補腎方治療AD有效成分及作用靶點、信號通路。可以看出，補腎方治療AD形成多靶點、多通路、多途徑協同作用網絡，并且可以推測槲皮素、山柰酚、木犀草素、脫水淫羊藿素、人參皂苷是其中重要的有效成分。AKT1、IL-6、CASP3、TNF、TP53是其比較重要的作用靶點。相關干預AD通路的機制主要包括：下調神經炎癥反應、防止蛋白質錯誤折疊、改善血管神經功能障礙、影響神經遞質、調節細胞代謝及線粒體功能等，并可以在疾病的早期、信號通路的上游進行干預。但由于目前對槲皮素、山柰酚、木犀草素的研究相對較多，因此本研究在線工具數據分析的結果可能出現一些偏倚，導致一些更重要的成分或者信號通路或許未能顯示[36]。由于中藥方劑不是化學成分的簡單疊加，藥效受中藥成分含量的影響，且中醫講究辨證論治，目前疾病靶點數據庫是針對西醫疾病名稱，而不是中醫病證，因此本研究具有一定局限性[37]。

綜上所述，本研究從系統網絡的角度探究補腎方治療阿爾茨海默病的機制，為進一步實驗研究奠定基礎，但需要今后進一步研究與驗證。