MTHFR基因多態(tài)性與兒童原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

王慧 劉巖巖 張?jiān)?陳曉麗 石琳,

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/首都兒科研究所，北京 100020；2.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100020；3.首都兒科研究所遺傳研究室，北京 100020）

近年來兒童原發(fā)性高血壓的發(fā)病率不斷增加［1］，已成為重要的公共衛(wèi)生問題，除肥胖、壓力及不良生活方式等影響因素外，遺傳易感性同樣不容忽視。研究表明，亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因多態(tài)性與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］，且存在顯著的地區(qū)和種族分布差異［4］，然而目前針對(duì)MTHFR基因的研究多集中于成年高血壓患者，C677T 是MTHFR基因最常見的突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)多態(tài)性在中國(guó)兒童高血壓患者中的分布尚不明確。基于此，本研究通過分析我院原發(fā)性高血壓兒童MTHFR基因C677T多態(tài)性分布特征，比較不同基因型組高血壓兒童的臨床資料，探討基因多態(tài)性與兒童H 型高血壓的相關(guān)性，為日后兒童高血壓的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021 年1～7 月在首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科住院且初次診斷未經(jīng)治療的原發(fā)性高血壓患兒為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡：10～18 歲；（2）籍貫為北京且常居籍貫所在地；（3）漢族；（4）高血壓診斷依據(jù)《中國(guó)高血壓防治指南（2018 年修訂版）》［5］：連續(xù)3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的收縮壓和/或舒張壓均大于或等于同年齡、性別和身高兒童血壓的第95 百分位數(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患繼發(fā)性高血壓者；（2）合并嚴(yán)重心血管、肝腎功能、惡性腫瘤及內(nèi)分泌異常疾病者；（3）近期使用過葉酸或維生素B12者。

該研究已通過首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SHERLL2019003），受試對(duì)象監(jiān)護(hù)人及受試者對(duì)相關(guān)檢查知情同意并簽署知情同意書。

1.2 臨床資料采集

回顧性收集患兒年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、家族史及血壓水平等一般資料，以及血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、葉酸、維生素B12水平等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。并對(duì)靶器官損傷情況進(jìn)行評(píng)估［6］，包括超聲心動(dòng)圖、心電圖、腎功能及眼底檢查等。

1.3 血清Hcy水平檢測(cè)

患兒至少空腹10 h，用不含抗凝劑的真空采血管抽取外周靜脈血4 mL，經(jīng)3000 r/min離心15 min（離心機(jī)半徑10 cm），分離上層血清用酶循環(huán)法檢測(cè)血清Hcy濃度，按照說明書進(jìn)行操作，Hcy檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)西門子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司。

1.4 基因多態(tài)性檢測(cè)

用EDTA抗凝管采集患兒外周靜脈血2 mL，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法按照T5 Direct PCR Kit（Blood）（北京擎科生物科技有限公司）說明書操作提取基因組DNA 并配制PCR 擴(kuò)增體系，用ABI3730xl 測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果由Mutation Surveyor V5.1.2 軟件分析和判讀，確定MTHFRC677T位點(diǎn)基因型。

1.5 H型高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)及分組

鑒于高同型半胱氨酸血癥與高血壓在腦卒中風(fēng)險(xiǎn)中的顯著協(xié)同作用，我國(guó)H 型高血壓定義為伴有血清Hcy≥10 μmol/L 的高血壓［7］，但高同型半胱氨酸血癥的判定尚存在爭(zhēng)議，兒童中亦無明確定義。本研究采用的Hcy檢測(cè)試劑盒的正常范圍為3.7～13.9 μmol/L，因此將伴血清Hcy＞13.9 μmol/L的原發(fā)性高血壓患兒分為H 型高血壓組，其余分為單純高血壓組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA 分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，事后成對(duì)比較采用Bonferroni法校正顯著性水平。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用單因素和多因素logistic 回歸分析計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（odds rations，OR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），以評(píng)估基因多態(tài)性與H 型高血壓的關(guān)聯(lián)性。樣本代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

研究期間共收治高血壓患兒179 例，其中2 例為繼發(fā)性高血壓，5 例年齡小于10 歲，47 例非北京籍貫，4 例拒絕參加研究，因此共納入121 例原發(fā)性高血壓患兒，其中男性95 例（78.5%），女性26 例（21.5%）， 平 均 年 齡（13.5±1.5） 歲，MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.578，P=0.749），表明該研究樣本人群具有較好的群體代表性。

2.2 基因分布特征

121 例原發(fā)性高血壓兒童MTHFR基因C677T位點(diǎn)CC、CT 和TT 基因型頻率分別為15.70%（19例），42.15%（51例）和42.15%（51例），C、T等位基因頻率分別為36.78%和63.22%，T 等位基因突變頻率高于北京地區(qū)健康成年人群［8］和中國(guó)漢族成年人群［9］（P＜0.001）。見表1。

表1 原發(fā)性高血壓兒童與成年人群MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性分布比較

2.3 不同基因多態(tài)性原發(fā)性高血壓患兒的臨床特征分析

CC 型組、CT 型組、TT 型組患兒間性別、年齡、BMI、收縮壓及舒張壓水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但血清Hcy 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。經(jīng)組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，TT 型組患兒血清Hcy 水平高于CC 和CT 型組（P＜0.001），但CT型組和CC型組血清Hcy水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同基因型組原發(fā)性高血壓兒童臨床資料比較

2.4 H型高血壓與單純高血壓患兒臨床特征比較

H 型高血壓組年齡大于單純高血壓組，血清Hcy 水平高于單純高血壓組（P＜0.05）；2 組間MTHFR基因C677T 多態(tài)性分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。2 組間靶器官損傷發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但H型高血壓組有12例為單臟器損害（心臟損傷2例，腎臟損傷9例，眼底損傷1 例），有5 例同時(shí)存在2 個(gè)臟器損害（心臟+腎臟損傷3 例，心臟+眼底損傷1 例，腎臟+眼底損傷1例），而單純高血壓組17例均為單臟器損害（心臟損傷7 例，腎臟損傷8 例，眼底損傷2 例）。見表3。

表3 H型高血壓組與單純高血壓組兒童臨床資料比較

2.5 基因多態(tài)性與H型高血壓相關(guān)性

以是否發(fā)生H型高血壓為因變量（是=1，否=0），納入年齡、性別、BMI、家族史和基因型進(jìn)行多因素logistic 回歸分析。在調(diào)整了年齡、性別、BMI、家族史后，結(jié)果提示TT 型與H 型高血壓發(fā)生存在相關(guān)性（OR=12.71，95%CI：4.81～33.53，P＜0.001）。見表4。

表4 基因多態(tài)性與H型高血壓關(guān)聯(lián)的logistic回歸分析

3 討論

對(duì)于個(gè)體而言，基因多態(tài)性堿基順序終生不變，因此開展基因檢測(cè)，按照基因多態(tài)性提供針對(duì)性治療，將會(huì)更符合精準(zhǔn)診療的要求。MTHFR是調(diào)節(jié)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，主要將四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，參與體內(nèi)DNA 合成和甲基化反應(yīng)［10］。目前成人MTHFR基因多態(tài)性的研究對(duì)象多為育齡期婦女或腦卒中病人，而兒童該基因位點(diǎn)的相關(guān)研究多集中在孤獨(dú)癥譜系障礙、急性淋巴細(xì)胞白血病和支氣管哮喘等，目前少有兒童高血壓相關(guān)的研究報(bào)道。

MTHFR基因位于1 號(hào)染色體短臂末端（1p36.3），由11 個(gè)外顯子和10 個(gè)內(nèi)含子組成，C677T 是MTHFR基因最常見的突變位點(diǎn)，其4 號(hào)外顯子第677 位的堿基胞嘧啶被替換為胸腺嘧啶，導(dǎo)致丙氨酸被纈氨酸替代而影響酶活性［11］，在中國(guó)人群中該位點(diǎn)T 等位基因的突變頻率高達(dá)45%［12］，顯著高于其他國(guó)家，而本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓兒童T 等位基因突變頻率高達(dá)63.2%，說明原發(fā)性高血壓兒童多存在不同程度的MTHFR基因缺陷和酶活性降低。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓兒童T等位基因突變頻率明顯高于北京地區(qū)健康成年人群和中國(guó)漢族成年人群，提示兒童高血壓的高發(fā)病率可能和MTHFR基因C677T 多態(tài)性具有一定相關(guān)性。而進(jìn)一步比較不同基因型原發(fā)性高血壓患兒的臨床資料可以發(fā)現(xiàn)，TT 型組血清Hcy水平顯著高于CT型組和CC型組，說明原發(fā)性高血壓兒童的血清Hcy 水平與MTHFR基因C677T 位點(diǎn)T等位基因具有一定關(guān)聯(lián)，由于等位基因C突變?yōu)門，降低了MTHFR酶活性，使得Hcy再甲基化途徑受阻，繼而導(dǎo)致血清Hcy水平升高，這與目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究［13-14］結(jié)果基本一致。綜合上述結(jié)果，我們考慮MTHFR基因多態(tài)性導(dǎo)致高血壓發(fā)生的機(jī)制可能主要與高同型半胱氨酸血癥相關(guān)，高同型半胱氨酸血癥可通過氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、降低一氧化氮生物利用度導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂、增加血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性及降低血管彈性等［15-16］多種機(jī)制引起血壓升高；此外，高同型半胱氨酸血癥還可導(dǎo)致DNA低甲基化，間接激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，參與高血壓的發(fā)生發(fā)展［17-18］。

我國(guó)高血壓患者中約75%伴有高同型半胱氨酸血癥，而高血壓與高同型半胱氨酸血癥在導(dǎo)致心腦血管事件上存在顯著協(xié)同作用，因此尋找合適的預(yù)警因素對(duì)H 型高血壓的早期預(yù)防及改善預(yù)后具有重要的臨床意義。向海卿等［19］研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T TT 型是連南瑤族自治縣人群H型高血壓發(fā)生的危險(xiǎn)因素；Tang等［20］研究也認(rèn)為MTHFR基因C677T TT型可能是H型高血壓的重要遺傳因素。而Huang 等［21］研究則認(rèn)為廣西壯族H型高血壓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與MTHFR基因C677T 多態(tài)性無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，H型高血壓組與單純高血壓組MTHFR基因C677T 多態(tài)性分布具有顯著差異，H 型高血壓患兒多數(shù)為TT 型，而單純高血壓患兒以CT型為主，TT型兒童發(fā)生H型高血壓的風(fēng)險(xiǎn)是CC/CT 型兒童的12.71 倍，提示MTHFR基因C677T TT型可能是兒童H型高血壓發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

兒童原發(fā)性高血壓癥狀多隱匿，但亞臨床靶器官損傷并不少見，是兒童高血壓預(yù)后評(píng)估的要點(diǎn)。成人高血壓的不良預(yù)后多為心肌梗死、腦卒中等，而兒童期多以心血管、腎臟、眼底等靶器官早期損傷為主。本研究中有34 例患兒在初次就診時(shí)即已出現(xiàn)靶器官損傷，盡管2組患兒的靶器官損傷發(fā)生率未見明顯差異，但H 型高血壓患兒中有5例同時(shí)存在2個(gè)臟器受累，提示H型高血壓兒童可能早期即存在更高程度的靶器官損傷，結(jié)合2組患兒血壓水平并無明顯差異，考慮這可能與高同型半胱氨酸血癥的協(xié)同作用有關(guān)。本課題組既往研究也表明H型高血壓患兒血Hcy水平與血壓變異性呈正相關(guān)［22］，而血壓變異性與原發(fā)性高血壓兒童的心室肥厚和腎臟早期損傷有密切關(guān)系［6］。因此臨床工作中對(duì)高血壓兒童應(yīng)重視血清Hcy 和MTHFR基因C677T 多態(tài)性的檢測(cè)，H 型高血壓患兒在控制血壓的同時(shí)應(yīng)積極降低血清Hcy水平，有望改善靶器官損傷程度，防止心腦血管惡性事件的發(fā)生。然而本研究樣本量相對(duì)較少，不能代表兒童原發(fā)性高血壓群體，今后需擴(kuò)大樣本量開展多中心研究以進(jìn)一步探索基因多態(tài)性在兒童高血壓診療中的價(jià)值。

綜上所述，原發(fā)性高血壓兒童MTHFR基因C677T 位點(diǎn)分布有自身特點(diǎn)，T 等位基因突變率高且與血清Hcy 水平具有一定關(guān)聯(lián)，TT 基因型是兒童H 型高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與早期靶器官損傷嚴(yán)重程度可能相關(guān)。因此臨床診療中應(yīng)對(duì)高血壓兒童進(jìn)行MTHFR基因檢測(cè)，篩選葉酸代謝能力異常的高危人群，根據(jù)遺傳特點(diǎn)提供針對(duì)性治療，對(duì)兒童H 型高血壓的早期預(yù)防和預(yù)后改善具有重要意義。