鄰近標記技術APEX2的發展與應用

羅思，丁明

（中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 211198）

研究活細胞細胞器和亞細胞區域的蛋白質組有助于理解細胞中組織和蛋白質相互作用網絡，因此興起了許多方法。基于鄰近標記的方法結合質譜（MS）的蛋白質組的系統分析為研究蛋白質的相互作用提供了一種高通量的方法。近年來，研究蛋白質相互作用的鄰近依賴標記技術也取得了很大發展。目前用于鄰近標記技術的酶主要有3種：辣根過氧化物酶（HRP）、鄰近依賴的生物素鑒定（BioID）和工程抗壞血酸過氧化物酶（APEX）。雖然第一個基于生物素鄰近標記的研究是利用HRP和芳基疊氮生物素做底物進行的[1]，但是HRP在哺乳動物細胞質中并不活躍。在細胞質的還原環境中，HRP的4個二硫鍵和2個Ca2+離子結合位點會被破壞，不能穩定維持自身結構[2]。這一缺陷限制了其在細胞內相互作用方面的使用，因此HRP逐漸退出蛋白質相互作用研究的舞臺。基于BioID的鄰近標記采用了來自大腸桿菌的生物素連接酶BirA的突變形式，利用質譜檢測BirA修飾生物素化蛋白，可以鑒定出與感興趣蛋白相互作用的微弱或者短暫的蛋白質，目前這種技術已成功用于天然環境中相互作用伙伴的生化篩選[3-5]。然而在BirA標記過程中，BirA的產物——生物素-腺苷酸酯的半衰期長達數分鐘，以至于它導致的標記半徑偏大，得到的結果假陽性偏多。此外BirA標記的速度很慢，通常需要18～24 h，因此很難研究高度動態的蛋白質相互作用。因此BioID技術不能很好地運用于亞細胞結構中蛋白質相互作用，為了提高空間和時間的特異性，APEX2技術則被開發出來[6-7]。隨著APEX2技術的不斷拓展，越來越多的科學家開始利用APEX2技術來解決一些以前難以研究的問題，例如亞細胞器中蛋白質的定位與分析、某些存在爭論的蛋白質的結構以及動態蛋白質復合物的識別與鑒定等。本文主要對APXE2技術進行總結與歸納，闡述其作用原理及APXE2技術在不同類型的相互作用的蛋白質組的應用。

1 APEX2技術的策略

1.1 工程抗壞血酸過氧化物酶（APXE2）

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是一種I類胞質植物過氧化物酶，與HRP不同，由于缺乏二硫鍵和鈣離子，所以能夠在還原環境中保持天然的活性[8]。野生型的APX并未在哺乳動物細胞中進行測試，并且其天然底物抗壞血酸鹽的結構與二氨基聯苯胺（DAB）基本不相同，加上APE是同型二聚體，嚴重影響蛋白質的天然定位和功能[9-10]，導致APE的適用性不大。隨后MARTELL等[11]在APE基礎上進行改造，最終得到一種名為APEX的單體抗壞血酸過氧化物酶；相對于APE而言，APEX不僅缺乏二硫鍵和鈣結合位點，可以在還原性的胞質環境中表達而不失去活性，并且其活性得到很大改善。經過改造過后的APEX，可以用于電子顯微鏡（EM）的細胞內特異性蛋白質成像[11]和空間分辨蛋白質組學定位成像[6-7]。然而APEX在使用過程中有一個很大缺陷——低靈敏度。當APEX表達量低時，其功能受到很大的局限性。因此LAM等[12]通過酵母展示和定向進化技術，在APXE的基礎上進行隨機突變，最終得到一種A134P的突變體，并命名為APEX2。它相對于APEX而言，具有相同的化學性質，但是其催化活性和表達量得到很大改善。由于APEX2標記過程產生的生物素-苯氧基自由基是短壽命的（＜1 ms），能夠產生一個較小的標記半徑（＜20nm），因此APEX2標記能夠提供更高的空間和時間特異性。為了解決對依賴于相互作用的鄰近標記工具的需求，HAN等[13]也在APEX2的基礎上，對其進一步定向進化改造，得到了一種叫做分裂的APEX（sAPEX），sAPEX技術擴展了鄰近標記的方法，具有更高的時空分辨率，將基于APEX方法的效用擴展到生物學的新領域。

1.2 APEX2的技術原理

APEX2技術原理可以分為兩大方向：①APEX2能夠在細胞內形成電子密度高的鋨，然后通過EM進行結構的判斷。活細胞可以在二氨基聯苯胺（DAB）和雙氧水（H2O2）的溶液中固定，APEX2可以催化DAB的聚合和局部沉積，隨后吸收電子密度較高的鋨，最后形成對比，最后用EM可視化APEX2的表達結構[11]。②APEX2能夠在通過生物素化鄰近蛋白質，從而進行蛋白質組學的分析。APEX2酶能夠在H2O2的存在下，將生物素-苯酚（BP）氧化成極短壽命（＜1 ms）和高度活性的自由基，然后它們可以共價連接到在鄰近的內源性蛋白質中的富含電子的側鏈氨基酸殘基上，從而對底物進行生物素標記[6，11]。通過去除H2O2和加上淬滅緩沖液，可以中止標記反應，然后可以利用鏈霉親和素的珠子分離得到生物素化蛋白，并通過質譜進一步分析[6-7]。

2 APEX2技術的應用

2.1 在不同細胞器和亞細胞結構域中蛋白質組學的應用

細胞器蛋白質組和亞細胞結構域的表征對于理解細胞組織、識別蛋白質復合物以及蛋白質相互作用網絡是必不可少的。APEX2技術介導的鄰近標記最早是由RHEE及其同事發現，其目的是規避傳統的線粒體純化的局限性和實現細胞器蛋白質組定位的時空特異性[6]。由于生物素-苯氧基自由基不具有膜透性，APEX2技術非常適合用于膜封閉的亞細胞室的蛋白質組學分析，例如線粒體基質、內質網、自噬體等結構。線粒體由外膜（OMM）、內膜（IMM）以及線粒體基質組成。線粒體基質是IMM所包圍的內部的亞細胞器區域，位于OMM和IMM之間的區域稱為膜間空間（IMS）。為了檢測APEX在蛋白質組學上的標記能力，RHEE等將線粒體基質靶向APEX用于人胚腎細胞（HEK），并結合雙態SILAC標記和MS進行相對定量，最終495個蛋白被鑒定為線粒體基質蛋白，其中94%的蛋白質有線粒體注釋，另外6%被認為是新的線粒體蛋白。此外一些先前被認為存在于IMS或OMM的蛋白質，包括原卟啉原氧化酶，被APEX技術得到的蛋白質組數據重新分配到線粒體基質的歸屬，并且通過電子顯微鏡證實。RHEE等的研究充分展示了APXE技術在面對基質的內膜蛋白和膜間空間（IMS）之間具有特別的特異性和區別。APEX介導的蛋白質組映射的特異性，結合其易用性，為生物學家了解活細胞的分子組成提供了一個強有力的工具。

隨后HUNG等[7]通過對線粒體IMS的研究，進一步證實APEX技術能夠實現空間和時間特異性蛋白質組的映射。此外APEX2也已經成功地應用于線粒體外膜和內質網外膜[14]和自噬體內腔[15]中蛋白質組的研究。APEX2技術除了應用于這幾個膜細胞器的研究外，有科學家將APEX2技術也成功應用于細胞核中蛋白質組學的研究[16]。核層（NL）是位于內部核膜下的細胞核的一個亞結構。NL的主要結構成分是中間絲蛋白，分為A型和B型。TRAN等[17]通過將APEX2融合到NL-B1蛋白中，成功地識別出NL近端蛋白、RNA、DNA。APEX的應用并不局限于膜封閉的細胞器的分析，它已成功地用于分析非膜封閉的細胞器的蛋白質組，如原發性纖毛[18]。

除了成功利用APEX技術來分析細胞器蛋白質組學分析外，APEX還為鑒定相互作用的蛋白質提供了一個很好的工具。例如將APEX2與內質網上的Ca2+傳感器STIM1融合，在活細胞中能夠很好地映射內質網和細胞膜連接的蛋白質組，也鑒定出STIM激活的增強子TMEM110（STIMATE）[19]。BERSUKER等[20]也將APEX2應用于脂滴相互作用的蛋白質組學研究，這種方法不僅鑒定到許多之前驗證過的脂滴蛋白，也揭示了新的脂滴蛋白，并且還能通過APEX2技術對脂滴動態蛋白質組學進行研究，揭示其調控機制。KE等[21]也是在APEX2的基礎上，通過對修飾的酚羥基結構進行設計，得到了高標記特異性的生物素-苯酚類似物，也同樣展示出APEX2技術能夠很好地應用于在活細胞內相互作用蛋白質的分析。

2.2 在蛋白質拓撲結構鑒定中的應用

除鑒定相互作用蛋白外，APEX2技術同樣具備強大的定位功能。Sigma-1受體（S1R）主要定位于內質網（ER），作為一個多能的細胞內信號分子，在細胞中有多種作用，包括離子通道調節、應激信號和轉錄調節，然而，這種蛋白質在細胞內的基本拓撲結構仍然存在爭議。由于關于ER膜中S1R蛋白確切拓撲結構的報道相互矛盾，MAⅤYLUTOⅤ等[22]應用APEX2技術，在全長S1R蛋白的N端或者C端連上APXE2，再利用APEX2技術能夠在細胞內形成電子密度高的鋨，然后通過EM進行結構判斷的原理，最終確定了全長S1R的N端面對細胞質，而C端面對內質網腔，成功地解決了Sigma-1受體N端和C端的拓撲結構的問題，展示出APXE2技術在爭論的蛋白質的結構上的強大定位功能。

2.3 在RNAs蛋白相互作用分析中的應用

APEX2不僅可以研究蛋白質的相互作用，還可以應用于分析細胞內RNAs的空間環境和RNA蛋白相互作用。不同的核糖核蛋白復合物控制mRNA的加工、翻譯和衰變。這些復合物中的轉錄本定位于細胞的特定區域，并可以凝結成非膜結合結構，如應激顆粒。然而，事實證明，繪制這些大型動態結構的RNA組成具有挑戰性。2019年，PADRóN等[23]利用APEX2技術，開發了一種名為APEX-seq的技術，解決了RNAs的定位問題，并且還鑒定出關鍵的RNAs結合蛋白。將空間轉錄組（如APEX-seq所揭示的）與空間蛋白質組（如APEX-質譜所確定的）進行匹配，精確地平行獲得，為研究活性mRNA的翻譯起始復合物的組織結構和應激顆粒組成提供了新的見解。APEX2技術允許一個強大的和通用的方法來探索大分子的空間環境。2020年，HAN等[24]也利用MS2-MCP系統和設計的CRISPR-Cas13系統將APEX2以高特異性靶向人端粒酶RNA hTR，在1 min的鄰近生物素化過程中，捕獲了hTR的候選結合伙伴，發現了12未鑒定過的hTR結合蛋白。MS2-和Cas13靶向的APEX2技術有助于發現活細胞中新的RNA蛋白相互作用。

2.4 在體內蛋白質組學中的應用

除了細胞水平外，APEX2技術也同樣適用于體內研究。CHEN等[25]通過構建mito-APEX，成功地將APEX2技術用于表征活果蠅肌肉細胞中的線粒體基質蛋白質組，實現了APEX2在體內的研究。利用APEX2技術建立了活果蠅組織的蛋白質組定位平臺，一旦激活，APEX2酶催化鄰近內源性蛋白質的生物素化，然后可以被分離并被質譜鑒定。APEX2技術在果蠅不同亞細胞室的多個組織中具有有效的標記功能，并繪制了果蠅肌肉線粒體基質蛋白質組圖，進一步證明APEX2技術在活細胞亞細胞蛋白質組表征方面的能力。

此外APEX2也已被進一步應用于酵母細胞，利用優化過的APEX2技術，HWANG等[26]在酵母細胞中鑒定出一個新的高爾基定位的蛋白酶Rbd2的結合蛋白——Cdc48，并表明該蛋白在Rbd2識別SREBP中的發揮作用。SINGER-KRüGER等[27]也在酵母細胞中，通過APEX2技術結合細胞培養中氨基酸的穩定同位素標記（SILAC），很好地展示膜封閉和半開放室、線粒體基質和細胞核的蛋白質組圖譜，并發現了一個全新的蛋白Yer156C。

3 總結

作為一種鄰近標記技術，APEX2技術不僅可以實現蛋白質相互作用的鑒定，也實現了亞細胞結構中蛋白質組學定位以及瞬時、動態的蛋白質復合物的識別，使得APEX2技術被越來越多的人所接受。APEX2技術能追蹤細胞內瞬時的、動態的分子間相互作用，更好地繪制分子間相互作用圖譜，獲得更為深入全面的生物學信息。相信在不久的將來，APEX2技術能夠成為研究生命科學問題主流手段。