生物鐘基因Cry1與動脈粥樣硬化相關性研究進展

程金鳳 王倩倩 甄萌萌 程艷麗

濱州醫學院附屬醫院心血管內科，濱州 256600

晝夜節律是生物體在生理和行為上約24 h為周期的生理性節律，控制晝夜節律的系統稱為生物鐘（circadian clock）［1］。生物鐘是生物在長期進化過程中形成的一種內源性適應機制，通過周期性的轉錄調節許多行為和生理功能，如睡眠-覺醒調節、血壓、脂質代謝以及激素的分泌［2-3］。生物鐘是由基因控制的，我們稱之為生物鐘基因（clock genes）［4］。Cry1作為其中一種主要的生物鐘基因，對維持細胞穩態和細胞周期具有重要的作用，其表達異常可導致生物體晝夜節律發生紊亂。Cry1的表達紊亂與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發生和發展具有一定關系。本綜述結合最新研究進展闡述生物鐘基因Cry1在AS中的作用，并探討其可能的機制。

生物鐘節律的分子機制

生物鐘可分為中樞生物鐘和外周生物鐘，哺乳動物的中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核（SCN），外周生物鐘存在于機體各組織細胞內。中樞生物鐘將內源性的晝夜節律與外部太陽日同步，隨后向外周生物鐘發送同步信號，使機體在組織水平上保持一致的節奏［5］。核心鐘基因和鐘控基因統稱為生物鐘基因，核心鐘基因主要有Clock和Bmal1（又稱arnt1）、Per1/2/3、Cry1/2。鐘控基因主要有Npas2、Rev-erbα、Hlf、Dbp、Tef、E4bp4、Stral3/dec1、Rorα、Ck1?等。

生物鐘作用的分子基礎是轉錄-翻譯負反饋環路，驅動時鐘組件有節奏的表達。此環路由2個激活因子（Clock和Bmal1）和2個抑制因子（Per和Cry）驅動，還包括調節磷酸化的激酶和磷酸酶，從而定位和穩定這些時鐘蛋白［1］。Clock與Bmal1的基因表達產物是具有堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）-PAS結構域的轉錄因子，二者結合形成異源二聚體Clock/Bmal1，在轉位到細胞核后，異源二聚體激活含有E-box順式調控增強子序列的靶基因Per和Cry的轉錄，并在細胞質中翻譯成Per和Cry蛋白，當Per和Cry蛋白積累達到一定濃度后，會形成穩定的Per/Cry異源二聚體從細胞質運輸到細胞核，這些異源二聚體通過作用于Clock/Bmal1復合體抑制自身的轉錄，形成主要的負反饋回路。當Cry、Per mRNA和蛋白質的濃度降低，一旦Cry-Per復合物的核水平不足以實現自抑制，新的Per和Cry轉錄周期就會開始。此外，異源二聚體Clock/Bmal1也可激活Rev-erbα的轉錄，Rev-erbα蛋白通過競爭結合維甲酸相關孤兒受體反應元件（ROREs）的啟動子，抑制Bmal1基因的轉錄，也可抑制Clock和Cry1基因的轉錄。因此，Bmal1可通過參與Rev-erbα的轉錄激活抑制自身轉錄。與Cry/Per復合物通過直接作用于Clock/Bmal1異源二聚體來抑制自身的表達不同，Rev-erbα通過抑制至少一種激活因子的轉錄來間接抑制自身的轉錄［6-8］。

生物鐘基因Cry1與AS

AS是以脂質代謝障礙為基礎的血管炎癥性疾病，是大多數心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的潛在病理。雖然最近在治療方面取得了一定的進展，但是AS及其并發癥依然是老年人死亡最常見的原因［9］。血脂異常、肥胖、糖尿病、高血壓和吸煙是已被證實的心血管危險因素，越來越多的研究表明晝夜節律的紊亂與CVD之間存在著顯著關聯［10］，Cry1基因的表達異常也影響著AS的發展。研究發現，與27例健康受試者（對照組）相比，招募的36例AS患者中Cry1 mRNA的表達顯著降低，在人促使斑塊形成的血管平滑肌細胞（VSMCs）中，包括Cry1在內的生物鐘基因表達水平減弱，增強斑塊破裂，影響AS的進程［11］。接下來從炎癥、高血壓、糖脂代謝方面探討生物鐘基因Cry1對AS發展產生的影響。

1、生物鐘基因Cry1與炎癥

AS是一種慢性炎癥性疾病，伴有內皮功能障礙、泡沫細胞形成、血管平滑肌細胞增生等復雜病理變化［12］。研究顯示，核心鐘基因Cry1的表達可能是炎癥過程的潛在影響因素［13］。Cry蛋白被證明是先天免疫和炎性反應的基本免疫調節成分。Cry1基因表達受損與血漿促炎細胞因子水平升高相關，如白細胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和 誘 導 型 一 氧 化 氮 合 酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）以細胞自主方式升高［8］。內皮功能障礙在CVD尤其是AS的發生發展中起著重要作用，是AS發展的早期發現和標志。核心鐘基因Cry1通過調節睡眠剝奪過程中的炎癥過程，在觸發內皮功能障礙中發揮重要作用。睡眠剝奪小鼠模型中，Cry1的表達減少，血管內皮細胞中的促炎細胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）、黏附分子［如血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、細胞間黏附分子（ICAM）-1、E選擇素（E-selectin）］表達增加，單核細胞與內皮細胞的結合增強，增加了AS的風險［13］。當在睡眠剝奪小鼠體內過表達Cry1后，促炎細胞因子和黏附分子的表達、單核細胞與內皮細胞的結合受到抑制，這意味著Cry1可能參與調節促炎細胞因子和趨化因子的表達。此外，過表達Cry1可以通過與腺苷酸環化酶相互作用抑制環磷酸腺苷（cAMP）的產生，Cry1蛋白的缺失減弱其對cAMP生成的抑制，導致cAMP水平升高和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活增加，隨后通過S276位點p65的磷酸化導致核因子（NF）-κB激活［8］。Qin與Deng［13］通過Western blot檢測睡眠剝奪小鼠主動脈內皮細胞中p65的磷酸化狀態，與對照組相比，睡眠剝奪組小鼠內皮細胞中p65的磷酸化水平顯著上調，而這一結果可被Cry1過表達顯著抑制。本實驗螢光素酶報告實驗結果進一步顯示，過表達Cry1顯著抑制NF-κB在內皮細胞中的活化。此外，過表達Cry1顯著降低Toll樣受體（TLR）2、TLR4蛋白的表達［14］。綜上所述，Cry1可以通過調控TLR/NF-κB通路緩解AS的發展。

2、生物鐘基因Cry1與高血壓

晝夜節律紊亂可導致醛固酮、腎素、血管緊張素Ⅱ和糖皮質激素等激素分泌的變化，這些激素在一定程度上與血壓的日常調節節律有關。血壓的變化取決于內源性和外源性因素。內部因素包括自主神經活動和體液因素（皮質醇、腎素、血管活性腸肽和醛固酮）。外部因素包括身體的活動、飲食、情緒狀態和睡眠/清醒狀態［2］。血壓的一個顯著特征是它的晝夜節律性，從黎明開始升高，中午達到峰值，下午下降，達到最小值［15］。健康人的夜間血壓會下降10%～20%。靜息血壓變化不超過10%的人被稱為“非杓型血壓”。鹽敏感性高血壓和非杓型高血壓可增加CVD的死亡風險［2］。

近年來的研究表明，晝夜節律機制在血壓調節中發揮著重要作用。高血壓組的小鼠Cry1水平明顯低于正常血壓組［2］。Doi等［16］在Cry1/Cry2基因敲除小鼠中研究了血壓，與對照組小鼠相比，Cry1-/2-小鼠的血壓晝夜變化特征消失，血漿醛固酮水平顯著升高，表現出鹽敏感性高血壓，使用選擇性醛固酮受體拮抗劑依普利酮，鹽敏感性高血壓表型可以得到改善［17］。3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）被認為是醛固酮合成過程中的一個限速步驟，在對導致Cry1-/2-小鼠腎上腺功能障礙的生成酶的研究中，發現了Hsd3b6是Cry基因失活導致小鼠鹽敏感性高血壓的關鍵酶。Hsd3b6是3β-HSD的一個亞型，僅在腎上腺球狀帶細胞中表達。在Cry1-/2-小鼠腎上腺中，Hsd3b6 mRNA水平升高，3β-HSD酶活性增強，使血漿醛固酮水平升高。人類Hsd3b1基因與小鼠Hsd3b6基因在功能上是對應的，因為Hsd3b1在人類腎上腺醛固酮生成細胞中表達［15-16］。

高血壓導致心血管事件的發生，其病理基礎是其供應血管發生動脈僵硬、AS、狹窄和閉塞［18］。因此早期診斷治療高血壓對治療AS病變有著重要作用。而血壓晝夜節律的紊亂會影響高血壓的預后，臨床指南也強調了將血壓維持在正常水平的重要性，因為嚴格控制血壓與降低主要心血管事件和死亡風險有著很強的相關性［19］。

3、生物鐘基因Cry1與脂代謝

AS是一種脂質來源的炎癥性疾病，涉及多細胞改變，以脂質斑塊形成為特征［12］。脂質是細胞膜和脂蛋白的組成成分，其作為細胞內、外的信號分子對細胞生理方面有著廣泛的影響。脂質代謝中有很多關鍵的轉錄調節因子，包括Rev-erb、ROR蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、PPARγ和PPARδ等。這些轉錄調節因子存在于肝臟、脂肪組織中，受到生物鐘的調控，并呈現晝夜節律表達，當晝夜節律障礙時，導致脂質代謝紊亂、肥胖和代謝疾病［20］。大量文獻表明，生物鐘基因影響脂質代謝關鍵限速酶、轉運蛋白和激素等表達，參與機體脂代謝反應調控，維持動物體內脂質平衡，防止脂肪過多堆積，這提示生物鐘在脂類代謝中有著重要的潛在功能。Ando等［21］的研究發現，ob/ob小鼠在代謝異常出現之前，脂肪組織中Cry1等生物鐘基因的表達就已經表現出降低現象，提示生物鐘基因表達異常先于脂肪代謝紊亂。Barclay等［22］的研究表明，Cry基因的缺失會增加飲食引起的肥胖癥易感性，高脂飲食的Cry1-/2-小鼠顯示出與脂肪攝取和生成相關基因FASN、ACC1、LPL、DGAT1的上調，出現脂質蓄積。此外，有研究表明，與高脂飲食喂養的ApoE-/-小鼠相比，過表達Cry1的ApoE-/-小鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）濃度均有所下降，小鼠主動脈竇斑塊面積減小［14］。ChREBP-α可驅動脂肪生成，從而導致肝臟脂肪變性的發生，最近的研究顯示，Cry1通過結合ChREBP-α的c-末端基序和降低ChREBP-α全長蛋白的豐度來促進ChREBP-α的降解，抑制脂肪生成［23］。綜上，Cry1可通過降低血脂水平延緩AS的進展。

4、生物鐘基因Cry1與糖代謝

高血糖是微血管并發癥的主要危險因素，其與動脈內膜中層厚度存在因果關聯，因此早期血糖控制可以降低心血管事件的發生。高血糖與血脂異常在AS形成中的作用密切相關，高血糖可加重血脂異常，也可對AS有獨立影響。許多研究表明，鏈脲霉素誘導的高血糖不伴脂質或脂蛋白異常，其可以促進ApoE-/-小鼠發生AS［24］。Veerman等［24］的研究表明糖尿病微血管病變可加快ApoE-/-糖尿病小鼠AS的發生和發展。

肝臟是哺乳動物主要的糖異生器官，與其他器官一起參與維持體內血糖水平的平衡［25］。生物鐘通過同步組織特異性的葡萄糖代謝機制維持血糖的生理水平［26］。Cry基因缺陷小鼠顯著降低糖異生基因的表達抑制，并使地塞米松誘導的基因表達水平升高，這表明Cry基因對糖皮質激素受體和糖異生基因轉錄有著顯著的抑制作用。此外，Cry1和/或Cry2基因缺失的小鼠出現了糖耐量下降、血液循環中皮質醇濃度升高的表現，提示Cry可能通過降低對下丘腦-垂體-腎上腺軸的抑制，增加糖皮質激素在肝臟中的轉化激活［27］。Zhang等［27］的實驗研究發現，禁食期間肝臟Creb的活動可由Cry1基因調節，它們在肝臟中有節律地表達。Cry1的表達在白-夜過渡期間升高，它能通過阻斷胰高血糖素介導的細胞內cAMP濃度的增加和PKA介導的環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMPresponse element-binding protein，Creb）磷酸化降低空腹糖異生基因的表達，如葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶-1（Pck1），最終降低血糖水平。研究顯示，與對照組相比，Cry基因敲除小鼠中糖異生基因的mRNA水平更高，而過表達Cry1下調了空腹注射胰高血糖素小鼠的糖異生基因表達，還降低了胰島素抵抗小鼠的血糖濃度并改善了胰島素敏感性［28］。另外，空腹或胰高血糖素誘導的cAMP濃度以24 h為周期波動，其波谷水平與Cry蛋白表達的峰值水平一致。Cry蛋白可能通過與G蛋白Gsα亞基的相互作用調節肝臟糖異生的晝夜變化，導致胰高血糖素觸發Creb磷酸化［29-30］。FOXO1（forkhead box O1）是糖異生關鍵酶G6pc、Pck1的正向調節劑，而Cry蛋白可以促進FOXO1的降解，從而抑制糖異生［31］。由此可以得知，肝臟中Cry1基因表達量的升高可以抑制cAMP的累積和Creb磷酸化的發生，進而抑制肝臟細胞中葡萄糖的濃度，降低患2型糖尿病的風險。

小結

越來越多的研究表明，晝夜節律紊亂已經成為AS形成和發展的危險因素，其中生物鐘基因Cry1是晝夜節律的一個重要組成部分，但是我們對Cry1作用機制的認識仍然有限。通過對近幾年的研究分析我們發現，生物鐘基因Cry1可以通過調節機體的炎癥、血壓、糖脂代謝以及內皮細胞功能來影響AS的進展。接下來我們需要進一步探索生物鐘基因，特別是Cry1基因，是通過何種機制來影響AS的發生發展。相信隨著對生物鐘基因研究的進一步深入，將會為我們尋找AS相關性疾病新的預防和治療靶點提供更充足的理論基礎。