中藥配方顆粒質量標準薄層鑒別與液相指紋圖譜/特征圖譜研究現狀及對照提取物應用可行性探討

饒麗芬 李泳雪 郭隆鋼

1廣州白云山奇星藥業有限公司，廣州 510530；2廣東省藥品檢驗所，廣州 510663；3廣州科曼生物科技有限公司，廣州 510700

自2001 年12 月1 日配方顆粒納入中藥飲片管理范疇，從此配方顆粒正式開始了產業發展和使用的歷史，并通過試點生產企業和試點醫院的推行，積累了大量的質量和臨床數據。多年來，國家藥品監督管理局以及國務院不斷對配方顆粒產業的發展和質量要求多次發文［1-4］。近3 年來，國家配方顆粒質量標準和地方標準也在不斷發文和完善中［5-6］。2021 年《國家藥監局國家中醫藥局國家衛生健康委國家醫保局關于結束中藥配方顆粒試點工作的公告》（以下簡稱《公告》）已正式發布，結束了長達20 年的中藥配方顆粒試點工作［7］。并開始了各省地區地方標準制訂的工作，使國家配方顆粒質量標準開展全國范圍的標準制訂工作有序進行。《公告》要求中藥配方顆粒省級標準的制訂應嚴格按照《中藥配方顆粒質量控制與標準制訂技術要求》執行，主要關注點包括：（1）研究用樣品的代表性；（2）標準湯劑研究的標準性；（3）工藝研究的合理性；（4）質量標準研究的科學性、嚴謹性；（5）質量標準復核的重要性［8］。截止到本文撰寫日，國家配方顆粒質量標準已經有196 個品種公布，各省地區也有多個質量標準發布，其中廣東省發布最多，共256 個［9］。從標準內容來看，多數省份與廣東省發布標準多個品種相同，這與廣東省作為中藥以及配方顆粒產業大省有密切關系。

目前，絕大多數配方顆粒質量標準都已經建立了薄層鑒別的方法，國家配方顆粒質量標準中，指紋圖譜有部分應用，特征圖譜有較多應用；在地方標準中，指紋圖譜少數應用，特征圖譜有較多應用。

國家配方顆粒質量標準中，黃柏配方顆粒［10］和枳殼配方顆粒［11］使用對照提取物作為薄層鑒別用標準物質；廣東省配方顆粒質量標準中，鹽巴戟天配方顆粒使用對照提取物用于薄層鑒別以及特征圖譜分析。

配方顆粒質量標準薄層色譜鑒別方法的應用情況及問題

目前已公布的196 個國家標準配方顆粒品種中，全部都有薄層色譜鑒別方法，大多數沿用了目前中國藥典相應藥材標準的薄層鑒別方法，少數品種有新的鑒別方法。

從1990 年版《中國藥典》開始，使用對照藥材作為薄層鑒別的參照物得到了廣泛應用，部分解決了當時中藥鑒別使用化學對照品缺乏專屬性的問題。薄層色譜亦得到了大范圍的應用和技術提高，然而翻閱后續多個版本的中國藥典，很多品種薄層鑒別方法并沒有進行修訂或提高，在2010 年版、2015 年版《中國藥典》的薄層色譜圖集中，一些新的薄層鑒別方法已經納入其中，但并未在中國藥典一部中進行修訂［12-13］。配方顆粒質量標準中大多數沿用中國藥典的薄層鑒別方法，已經有幾十年未有修訂，隨著薄層色譜技術的發展和儀器、薄層板等耗材的不斷進步，有些陳舊的方法已經不適應現有檢測條件，前處理復雜、有毒試劑如氯仿等作為提取溶劑、顯色劑不合理的情況時有出現，增加了配方顆粒質量標準應用時的操作難度以及安全隱患。相對液相指紋圖譜/特征圖譜來言，薄層鑒別的分離度相對較低，操作中實驗者的人為因素影響較大，實驗水平差異巨大，導致薄層色譜的技術和操作規范性的重視程度遠遠不夠，這也是配方顆粒質量標準中薄層鑒別方法并無較大提高的原因之一。

如人參配方顆粒質量標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2-21186）［14］薄層鑒別仍沿用中國藥典中樣品前處理方式：取本品0.2 g，研細，加水0.5 ml 攪拌濕潤，加水飽和正丁醇10 ml，超聲處理30 min，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取人參對照藥材1 g，加水50 ml，煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至近干，加水飽和正丁醇10 ml，同法制成對照藥材溶液。對照藥材溶液的制備前處理復雜，且正丁醇沸點較高（117.25 ℃），導致整個前處理過程耗時較長，目前大多數國家配方顆粒標準或各省地方標準中薄層鑒別所使用對照藥材做為參照物的制備方法中均需要先加水煎煮再進行前處理，大大增加了操作時間。

再如大青葉配方顆粒質量標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2021033）［15］、杜仲配方顆粒質量標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2021040）［16］、鉤藤（鉤藤）配方顆粒質量標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2021052）［17］、浙貝母配方顆粒質量標準（粵PFKL0117）［18］多個品種中，薄層鑒別中供試品制備使用三氯甲烷作為提取溶劑，毒性較強。

再如炒白芍配方顆粒質量標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2021016）［19］、赤芍（芍藥）配方顆粒質量標準（國家藥品標準 YBZ-PFKL-2021026）［20］薄層鑒別所用顯色劑為5%香草醛硫酸溶液，酸棗仁配方顆粒質量標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2021191）［21］薄層鑒別所用顯色劑為1%香草醛硫酸溶液，其硫酸均為濃硫酸，腐蝕性強，在噴霧顯色操作中需要有足夠好的通風和保護條件，否則對于操作人員健康會造成傷害，且濃硫酸吸水性極強，導致在日常濕度較大的省份很容易在顯色后吸水放熱，整個薄層板面斑點有大量水印影響判斷，可使用1%香草醛-10%硫酸甲醇（或乙醇）等顯色劑更為合理。

現有大部分薄層鑒別方法的展開劑經過了多年的應用，基本可以滿足鑒別的需求，供試品處理以及顯色條件方面的改變，所需預實驗難度遠遠低于展開劑的選擇，希望這些沿用多年的方法可以做出更人性化的修訂，從而提高檢測的效率、安全性和可靠性。

配方顆粒質量標準指紋圖譜/特征圖譜方法的應用情況及問題

在國家及地方配方顆粒質量標準中，指紋圖譜/特征圖譜作為中藥多成分質量分析的重要方法得到了廣泛應用，將配方顆粒整體質量標準提高了一個檔次，是配方顆粒質量標準乃至中藥質量標準的重大進步，其涵蓋范圍遠遠超過目前2020 年版《中國藥典》中的藥材質量標準的應用數量。

在現行配方顆粒質量標準指紋圖譜/特征圖譜的方法中，大部分在參照物溶液部分使用了對照藥材或對照飲片作為多成分的參照物，少部分使用化學對照品作為參照物，并以計算相對保留時間的方法作為分析判斷的標準。

在標準起草及復核過程中，特征圖譜的特征峰相對保留時間問題有較多爭議和討論。使用不同的色譜儀器以及色譜柱時，相對保留時間有個別超出標準制訂的范圍，但并不能作為判斷其質量不合格的標準。使用對照藥材作為隨行對照，在一定程度上可以解決該問題，但由于對照藥材/對照飲片與已經經過工業化生產的配方顆粒在很多品種上成分有著較大差異，為了解決此問題，參照物中對照藥材/對照飲片的供試品溶液制備方法往往需要先使用水煎煮，再進行進一步的處理，大大增加了前處理難度，且實際應用中依然有部分品種無法通過使用對照藥材/對照飲片做隨行對照來解決相對保留時間的問題，這與對照藥材/對照飲片本身或因不同批次或產地導致的內在成分差異相關。

解決此問題的備選方案中，使用配方顆粒對照提取物作為參照物是更為可行的方法。廣東省配方顆粒質量標準中，鹽巴戟天配方顆粒［22］的薄層鑒別以及特征圖譜首先使用了對照提取物作為參照物，從技術角度來講是一個進步，其特征圖譜分析結果見圖1、圖2。

圖1 鹽巴戟天配方顆粒環烯醚萜類指紋圖譜

圖2 鹽巴戟天配方顆粒寡糖類特征圖譜

將對照藥材供試品制備方式按照水煎煮處理后進一步處理，所得到對照藥材溶液特征圖譜仍與飲片或者配方顆粒有較大不同。鹽巴戟天為經過炮制（有蒸制這一步）的飲片，其中環烯醚萜類和寡糖類成分均會產生變化，故而使用巴戟天對照藥材作為鹽巴戟天配方顆粒質量標準的參照物不夠合理。經過標準化制備的配方顆粒對照提取物則更加適合本品種特征圖譜分析使用，其色譜行為與鹽巴戟天飲片（按照標準湯劑制備方法制備樣品）更為一致。

另有部分品種特征圖譜色譜峰較多，多個特征峰保留時間很接近，給結果判定帶來一定難度，如靈芝（赤芝）配方顆粒質量標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2021086）［23］，見圖 3。

圖3 國家藥品標準YBZ-PFKL-2021086靈芝（赤芝）對照特征圖譜

國內對照提取物生產廠家與歐洲藥典會在關于赤芝質量標準標準物質、赤芝對照提取物應用于SST（系統適應性實驗），實驗討論中所使用超高效液相色譜（UPLC）色譜分析方法多個色譜峰分離度較好，值得參考借鑒，見圖4。

圖4 歐洲藥典會赤芝質量標準草案赤芝樣品及對照提取物UPLC指紋圖譜

對照提取物應用于配方顆粒質量標準的可行性探討

1、研究背景介紹

對照提取物/標準提取物在近年來國內外質量標準的應用范圍逐漸擴大，此技術方法在20 世紀90 年代德國銀杏葉制劑中已經開始使用，使用標準提取物結合指紋圖譜分析的方法，銀杏葉制劑得到了有效的質量控制，從含量上有上下限的要求，從多個成分指認上使用色譜峰指紋圖譜相似度來控制，此種手段還解決了當時國內銀杏葉制劑質量的若干問題，如使用蘆丁摻假以提高黃酮含量等［24-25］。

配方顆粒質量標準其核心離不開對于“標準湯劑”的研究，國家藥監局配方顆粒質量標準指導原則中要求不得少于15 批原料制備得到“標準湯劑”，并進一步分析其出膏率、轉移率、指紋圖譜/特征圖譜色譜峰指認等數據，此要求對于控制配方顆粒的質量穩定有著重要的指導意義。根據“標準湯劑”得到的指紋圖譜/特征圖譜為質量標準的標準圖譜，而參考“標準湯劑”制備工藝經標準化制備的配方顆粒對照提取物，則可作為多成分的標準物質，數據化的標準圖譜離不開標準物質的實體，并且隨著分析手段的不斷進步，標準圖譜的優化可以使用對照提取物來進一步開發方法，使得標準的不斷提高和圖譜的不斷進步一直有標準物質的實物作為參照，兩者不可缺少。

2021 年中檢院發布的《對照提取物技術指導原則》以及廣東省藥品檢驗所發布的《標準物質研制技術指導原則》中，對于對照提取物以及配方顆粒中對照提取物的研制規范有明確要求，要求基原明確，原料不得少于15 批，對于薄層鑒別以及特征圖譜鑒別用的對照提取物其批間相似度不得低于0.95，對于指紋圖譜分析用的對照提取物其批間相似度不得低于0.985。在實際執行中參照“標準湯劑”的要求以及相關指導原則的要求，對照提取物作為實驗室規模可以制備的標準物質，可以較容易控制到與“標準湯劑”的一致性以及代表性。結合配方顆粒質量標準中薄層鑒別，指紋圖譜/特征圖譜分析的需求，對照提取物是更為合理的隨性參照物。該標準物質具備比對照藥材/對照飲片更為均一和批間一致性高的優勢［26］，前處理較簡單，可減少實驗人員的操作難度以及由此帶來的操作誤差。

2、對照提取物應用于配方顆粒質量標準部分品種的研究情況及所解決問題的討論

2.1、枳殼對照提取物 使用枳殼對照提取物對7 批不同廠家生產的枳殼配方顆粒進行薄層色譜與高效液相指紋圖譜色譜的分析，圖譜見圖5～8。

圖5 枳殼ERS與枳殼顆粒TLC圖譜（黃酮苷類）

現行標準中關于特征圖譜色譜峰相對保留時間有明確規定，然而在使用相同粒徑但不同柱長的色譜柱時，得到的色譜如圖8。

圖8 枳殼配方顆粒指紋圖譜分析

雖然各特征峰均有較高的分離度，但經計算多個色譜峰的相對保留時間不在公示質量標準范圍內。若使用對照提取物計算色譜相似度，則樣品#2、#3、#5、#6、#7 與對照提取物相似度＞0.9，質量較好，其質量情況亦可以在薄層色譜中反映出同樣的結果。使用對照提取物為參照物可以適用于枳殼配方顆粒指紋圖譜分析，說明使用對照提取物可以解決部分靠單純計算相對保留時間而引起的誤判問題。

2.2、黃柏對照提取物 使用黃柏對照提取物對收集自中國臺灣地區和大陸的14 批配方顆粒進行薄層色譜分析，結果見圖9。

圖9 黃柏對照提取物與黃柏配方顆粒TLC圖譜

圖譜顯示不同廠家之間黃柏配方顆粒的質量有明顯差異，大陸幾家廠家的配方顆粒質量相對穩定，需要注意的是使用碘化鉍鉀對黃柏中生物堿類成分顯色時，需噴以足夠量的顯色劑才可以得到清晰圖譜，在實際操作中若不注意則待檢測斑點顏色會較淺或者無法顯示，薄層色譜操作的規范化對于實驗結果的判斷非常重要。

圖6 枳殼ERS與枳殼顆粒TLC圖譜（黃酮苷元類）

圖7 枳殼配方顆粒國家標準對照特征圖譜

2.3、黃芪（蒙古黃芪）配方顆粒質量標準特征圖譜高效液相色譜/蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）結果分析 對一批黃芪（蒙古黃芪）配方顆粒進行特征圖譜中HPLC-ELSD 分析，并對兩批對照藥材同步進行分析，得到的結果見圖10。

圖10 黃芪（蒙古黃芪）配方顆粒及對照藥材HPLC-ELSD圖譜

所收集兩批中檢院的黃芪對照藥材，其中現有批次為120974～201612，另一批時間較久，使用兩者按照配方顆粒公布標準（國家藥品標準YBZ-PFKL-2021065）特征圖譜分析的方法分析，發現兩批圖譜差異巨大，可能跟批號974-9905 已過期有關，但現有批次成分與配方顆粒樣品以及公布稿的對照特征圖譜仍有較大差異，且在此條件下無法找到4 號峰及5 號峰。使用黃芪（蒙古黃芪）配方顆粒對照提取物作為參照物分析結果見圖11。

圖11 黃芪（蒙古黃芪）配方顆粒及對照提取物HPLC-ELSD圖譜

兩者圖譜中5 個色譜峰均對應一致，對照提取物可以作為配方顆粒特征圖譜的隨行對照參照物，經過標準化的制備，對照提取物極大減少標準物質的批間差異。

2.4、炒赤芍（芍藥）配方顆粒對照提取物 在本品中對照提取物的研發過程中，收集樣品階段發現赤芍（芍藥）樣品目前存在有較多的摻偽情況，經進一步調查，發現偽品多為“山赤芍”（習稱），從2016 年開始，在山西及西北地區有較多的“家種赤芍”，其飲片外觀與傳統的野生赤芍非常接近，然而經分析其成分含有較多的芍藥內酯苷（圖12），而正品野生赤芍（芍藥）基本不含芍藥內酯苷，白芍中此成分常見，猜測在種植過程中農戶所使用種子有誤。按照目前中國藥典赤芍藥材標準及地方標準中炒赤芍飲片標準，均無法對其進行有效區分，僅僅以芍藥苷作為指標成分或僅僅使用部分特征峰指認，將無法對“山赤芍”進行辨認，在標準執行中可能會出現投料有誤但無法檢出的問題。希望相關部門和標準起草單位引起一定的重視。

圖12 赤芍及“山赤芍”部分樣品分析

總結

現行配方顆粒質量標準的優點：（1）針對每個基原有單獨的質量標準，確保了原料基原的穩定。（2）制法有明確的量化數據，控制了生產工藝的穩定。（3）大量應用特征圖譜分析方法并部分應用指紋圖譜分析方法，做到了配方顆粒質量的整體控制。（4）指標成分含量設置上下限并確定了其規格相當于藥材的比例，保證了配方顆粒質量的相對穩定。

存在的部分問題：（1）薄層色譜方法陳舊，條件待完善。（2）在省級質量標準制訂中標準物質不足或難以找到法定標準物質，對質量標準的提升不利。（3）特征圖譜/指紋圖譜色譜峰指認對于儀器及色譜柱的要求苛刻。

對配方顆粒質量標準薄層鑒別與液相指紋圖譜/特征圖譜方法的幾點建議：（1）建議對薄層色譜方法進行優化，尤其在前處理、顯色劑方面進行簡單優化，以方便實驗操作。進一步針對配方顆粒專屬性的成分開發薄層色譜鑒別方法。（2）建議在研究中逐步將特征圖譜替換為指紋圖譜分析，更能保障其質量穩定可控。（3）建議廣泛應用配方顆粒對照提取物在薄層色譜鑒別、特征圖譜/指紋圖譜分析中。

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