中藥炮制輔料膽汁質(zhì)量標準研究*

劉小鳴，王瑞生，任躍紅，張振凌，石延榜

（1.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450008；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450008；4.暨南大學，廣東 廣州 510000）

膽汁作為中醫(yī)傳統(tǒng)用藥，種類繁多，不僅可以單用，還是中藥炮制常用液體輔料之一。膽汁作為藥用輔料最早見于宋代《小兒藥證直訣》中牛膽汁制南星“臘月釀牛膽，陰干百日”[1]。通過查閱資料可知，中藥炮制輔料用膽汁主要為牛、豬、羊的新鮮膽囊汁[2]。膽汁性味苦寒，藥物與膽汁共制后，可增強藥物清肝明目、利膽通便的作用，且能降低藥物的毒性和燥性，從而達到“減毒增效”的目的。作為常用液體輔料，膽汁用量較大，但目前尚無規(guī)范的膽汁輔料質(zhì)量標準可供參考。僅1953年版《中華人民共和國藥典》[3]收載了牛膽汁浸膏，但在后來的藥典中并未沿用；1977年版《中華人民共和國藥典》[4]首次收載膽南星；1985年版《中華人民共和國藥典》[5]修訂了膽南星的用量和功能主治，并沿用至今，未見其他膽汁炮制品種[6]；2020年版《中華人民共和國藥典》[7]僅在“人工牛黃”項下規(guī)定了其原料之一“牛膽粉”的質(zhì)量標準，未見炮制輔料用膽汁的質(zhì)量標準收錄。因此，膽汁輔料使用時無法可依，部分飲片生產(chǎn)企業(yè)使用的膽汁輔料質(zhì)量參差不齊，膽汁炮制飲片合格率無法保證，不利于中藥飲片的質(zhì)量管控，影響其臨床療效。因此，急需制訂科學合理的膽汁輔料質(zhì)量標準，為膽汁和膽汁炮制品種的監(jiān)督管理和臨床規(guī)范化使用提供依據(jù)[8]。

本研究以中藥炮制輔料用膽汁為研究對象，收集不同批次的牛、豬、羊膽汁，對其進行質(zhì)量分析，包括性狀、理化和薄層鑒別，異性膽汁、相對密度、異性有機物和水分檢查及總膽酸含量測定，制訂膽汁輔料標準。此外，本研究采用膽汁發(fā)酵天南星，按照2020年版《中華人民共和國藥典》對膽南星飲片進行質(zhì)量檢測，從而評價輔料膽汁質(zhì)量，旨在研究制訂膽汁質(zhì)量標準，為膽汁制中藥飲片臨床應用的安全性和有效性提供依據(jù)，同時為中藥飲片炮制輔料膽汁質(zhì)量標準的制訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BCD-636WD11HPA型冰箱（海信容聲冰箱有限公司）；1200型冷藏柜（廣翔制冷設備有限公司）；BSA224S-CW型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ATS4型全自動薄層點樣儀（瑞士卡瑪公司）；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；ZHPW-70型臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱、HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司）；HH-S.6S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市華普達教學儀器有限公司）；B1-233型生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；UV-3200S型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）；114B型搖擺式高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試劑 膽酸對照品（批號：T16J8Q28663，質(zhì)量分數(shù)≥99%）、?；悄懰徕c對照品（批號：M02J9E52008，質(zhì)量分數(shù)≥99%）、牛膽粉對照藥材（批號：K04D11B133100，質(zhì)量分數(shù)≥99%）均購自上海源葉生物科技有限公司；豬膽粉對照藥材（批號：V6NB-SRDE，質(zhì)量分數(shù)≥99%）、羊膽粉對照藥材（批號：ZJWJ-WXA8，質(zhì)量分數(shù)≥99%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G板（批號：20190307）、磷鉬酸（批號：20020916，分析純）均購自青島海洋化工有限公司；硫酸（批號：20190521）、甲苯（批號：20090603）均購自煙臺市雙雙化工有限公司；甲醇（批號：20201110，分析純）、冰醋酸（批號：20160822，分析純）、無水乙醇（批號：20200525，分析純）、95%乙醇（批號：20200525，分析純）、正丁醇（批號：20190415，分析純）均購自天津市富宇精細化工有限公司；高活性干酵母粉（批號：12000813）購自安琪酵母股份有限公司；糠醛（批號：C11893179，分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司；水為蒸餾水由實驗室超純水機制備。

1.3 材料 共收集牛膽15批、豬膽3批、山羊膽3批。天南星、虎掌南星各1批，具體樣品信息見表1。牛膽、豬膽、羊膽樣品均儲存于0 ℃以下的冰箱中。使用時取出膽囊，待其解凍完全，用潔凈的剪刀剪破膽囊擠出膽汁，倒入燒杯中使用。儲存時用保鮮膜封口放入冷藏柜中。

表1 膽汁和天南星樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 運用人體感官對21批膽汁樣品進行鑒別，如用眼看、鼻聞、口嘗、手摸等方法。觀察所收集的膽汁樣品實際情況，參照各省市標準、規(guī)范，總結(jié)樣品的性狀特征。（見表2）試驗過程中發(fā)現(xiàn)膽汁的顏色隨時間的變化可能有些許差異，根據(jù)觀察擬描述中藥炮制輔料用膽汁的性狀為：具有一定黏度的棕黃色至黃綠色或至綠褐色、半透明液體，氣微腥，味極苦。

表2 膽汁樣品性狀鑒別結(jié)果

2.2 理化鑒別 膽汁中含有大量膽汁酸，主要活性成分為膽酸類[9]。參照《遼寧省中藥材標準第二冊（2019年版）》[10]及文獻[11]中對牛膽汁的理化鑒別方式（Pettenkofer氏呈色反應和Gregory-Pettenkofer氏反應）進行鑒別。取樣品5 mL置于試管中，滴加新制1%糠醛水溶液3～4滴，沿管壁慢慢加入1 mL濃硫酸，觀察現(xiàn)象；繼續(xù)滴加2 mL濃硫酸并充分振搖，觀察現(xiàn)象并拍照記錄。取樣品1滴置于帶塞試管中，加新制1%糠醛水溶液0.5 mL，再加45%硫酸溶液6 mL，振搖后于75 ℃水浴中加熱30 min。Pettenkofer氏呈色反應結(jié)果顯示，沿管壁加入1 mL濃硫酸后試管上層均出現(xiàn)黃色絮狀物，下層顯紫色；繼續(xù)滴加2 mL濃硫酸并充分振搖，溶液均顯紫紅色，證明膽汁樣品中均含有膽汁酸類成分。Gregory-Pettenkofer氏反應實驗結(jié)果顯示溶液均顯深藍色，證明膽汁樣品中均含有膽酸。

2.3 薄層鑒別 參照《遼寧省中藥材標準第二冊（2019年版）》[10]中對牛膽汁的薄層鑒別方法，以牛膽粉、豬膽粉、羊膽粉對照藥材以及膽酸對照品、?；悄懰徕c對照品作為對照，對3種膽汁分別進行鑒別。取膽汁樣品各1 mL，分別置錐形瓶中，加甲醇15 mL，超聲處理40 min使其充分溶解，靜置，過濾，取續(xù)濾液，即得。另精密稱取牛膽粉、豬膽粉、羊膽粉對照藥材，按照與供試品溶液制備相同的方法制成每1 mL含5 mg對照藥材的對照藥材溶液。再精密稱取膽酸對照品、?；悄懰徕c對照品，按照與供試品溶液制備相同的方法分別制成每1 mL含1 mg對照品的對照品溶液。15批牛膽汁以牛膽粉對照藥材、膽酸、?；悄懰徕c為對照；3批豬膽汁以豬膽粉對照藥材、膽酸對照品為對照；3批羊膽汁以羊膽粉對照藥材、膽酸對照品、牛磺膽酸鈉對照品為對照；吸取上述溶液各3 μL，分別點于3個不同的硅膠G薄層板上，以甲苯-冰醋酸-水（10∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱約5 min至斑點顯色清晰。日光下觀察薄層色譜，發(fā)現(xiàn)15批牛膽汁供試品色譜中，均與牛膽粉對照藥材、膽酸對照品、?；悄懰徕c對照品在相同位置顯示相同的斑點；3批豬膽汁供試品色譜中，均與豬膽粉對照藥材、膽酸對照品在相同位置顯示相同的斑點；3批羊膽汁供試品色譜中，均與羊膽粉對照藥材和膽酸對照品、?；悄懰徕c對照品在相同位置顯示相同的斑點。（見圖1～3）

圖1 牛膽汁薄層鑒別圖

圖2 豬膽汁薄層鑒別圖

圖3 羊膽汁薄層鑒別圖

2.4 牛膽汁中的豬膽汁鑒別 2020年版《中華人民共和國藥典》[7]規(guī)定膽南星的輔料用膽汁仍是牛膽汁、羊膽汁或豬膽汁，且3種膽汁輔料的應用在各省市中藥飲片炮制規(guī)范中也未加以區(qū)分，但經(jīng)過市場調(diào)研，在實際生產(chǎn)中由于牛膽汁較稀有，常常被混入劣質(zhì)豬膽汁導致輔料質(zhì)量參差不齊、飲片質(zhì)價不一[12]。因此，在使用單一來源的膽汁輔料時建議區(qū)分開來，可采用簡單快速的薄層鑒別方法進行豬膽汁檢查以保證牛膽汁的質(zhì)量。以豬膽粉和牛膽粉為對照藥材，按與供試品溶液制備相同的方法制成每1 mL含5 mg的對照藥材溶液。采用“2.3”項下方法制備供試品溶液并鑒別。日光下觀察薄層色譜，發(fā)現(xiàn)15批牛膽汁供試品色譜中，均與牛膽粉對照藥材在相同位置顯示相同顏色的斑點；豬膽粉對照藥材顯示的某些斑點并未在供試品的相同位置出現(xiàn)，說明該15批牛膽汁中無豬膽汁摻雜。（見圖4）

圖4 豬膽汁檢查薄層色譜圖

2.5 相對密度檢查 由于純物質(zhì)的相對密度在特定條件下不改變，因此測定膽汁樣品的相對密度可在一定程度上反映藥品的純雜程度。參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部相對密度測定法（通則0601）比重瓶法測定室溫下膽汁的相對密度，結(jié)果見表3，相對密度在1.020～1.043的范圍內(nèi)。根據(jù)結(jié)果建議膽汁相對密度不得低于1.020。

2.6 異性有機物檢查 考慮到膽汁在收集加工過程中可能會存在人為增重而摻入其他異性雜質(zhì)如植物組織、動物組織或淀粉等的汁液而影響膽汁的質(zhì)量，故設計試驗對膽汁樣品進行異性有機物檢查。取本品2 mL，離心，傾去上清液，取不溶物做成水裝片，置顯微鏡下觀察。膽汁樣品離心后的不溶物水裝片顯微觀察少見有圓形或橢圓形脂肪粒，并未見其他植物、動物組織或淀粉粒等，證明膽汁樣品中均無異性有機物摻入。（見圖5）

圖5 膽汁異性有機物檢查脂肪粒顯微特征圖（×100）

2.7 水分檢查 按照2020年版《中華人民共和國藥典》四部水分測定法（通則0832第二法）對21批膽汁進行水分測定并據(jù)此制訂膽汁輔料的水分限度。水分含量為86.53%～94.00%。根據(jù)結(jié)果建議膽汁水分不得超過94.00%。（見表3）

表3 膽汁樣品水分、相對密度、膽酸含量測定結(jié)果

2.8 膽酸含量測定 膽汁酸及其鹽類是膽汁的主要有效成分，其中膽酸具有很強的生物活性，因此對膽汁輔料中的總膽酸含量進行測定可對其質(zhì)量進行有效控制，保證臨床用藥的有效性。因膽汁中的膽汁酸及其鹽類化合物具有甾體的母核結(jié)構(gòu)，能與顯色劑產(chǎn)生穩(wěn)定的顏色反應，顯色產(chǎn)物在紫外-可見光區(qū)有選擇性吸收[13-14]，因此，采用紫外-可見分光光度法對膽汁樣品中的總膽酸進行含量測定。

2.8.1 供試品溶液的制備 精密吸取膽汁樣品0.25 mL，置50 mL量瓶中，加60%冰醋酸溶液適量，超聲處理5 min，用60%冰醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.8.2 對照品溶液的制備 精密稱取膽酸對照品5.0mg，置10mL容量瓶中，加60%冰醋酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含膽酸0.5 mg的對照品溶液。

2.8.3 方法學考察

2.8.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置具塞試管中，各管加入60%冰醋酸溶液稀釋成1.0 mL，再分別加新制1%糠醛水溶液1.0 mL，搖勻，在冰浴中放置5 min，精密加入10∶13的硫酸水溶液13 mL，混勻，在70 ℃水浴中加熱10 min，迅速移至冰浴中，放置2 min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在605 nm波長處測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得膽酸回歸方程Y=1.419 6X+0.003 7，R2=0.999 5。結(jié)果表明膽酸在0.100 32～0.501 60 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。膽酸標準品線性關(guān)系測定結(jié)果見圖6。

圖6 膽酸對照品吸光度-濃度標準曲線圖

2.8.3.2 精密度試驗 取質(zhì)量濃度為0.501 60 mg/mL的膽酸對照品溶液，測定其在605 nm處的吸光度，重復6次。結(jié)果表明膽酸的平均吸光度值為0.723，RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.8.3.3 穩(wěn)定性試驗 選取N1號牛膽汁樣品，按“2.8.1”方法制備，將其在室溫下分別放置0、1、2、4、6、8 h，依次測定吸收度，結(jié)果不同時間吸光度的RSD為0.55%，表明供試品溶液在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.3.4 重復性試驗 隨機精密吸取N1號牛膽汁樣品6份，按“2.8.1”方法制備，分別測定吸光度。結(jié)果表明N1號牛膽汁所含膽酸平均含量為49.12 mg/mL，RSD為0.79%，表明該方法重復性良好。

2.8.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取膽酸對照品一定量，置容量瓶中，加60%冰醋酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含膽酸1 mg的對照品溶液；精密吸取已知含量的膽汁樣品6份，分為3組，按80%、100%和120%的比例分別加入膽酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為1 mg/mL）一定量，按上述測定樣品吸光度方法測定，計算含量，按公式（1）計算回收率。結(jié)果表明樣品中膽酸的平均加樣回收率為101.19%，RSD為1.78%，表明加樣回收率良好，該方法可靠。

2.8.4 膽酸含量測定 精密吸取膽汁樣品一定量，置50 mL量瓶中，加60%冰醋酸溶液適量，超聲處理5 min，用60%冰醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液各1 mL，分別置甲、乙兩個具塞試管中，于甲管中加新制1%糠醛水溶液1 mL，乙管中加水1 mL作空白，照標準曲線制備項下的方法，自“在冰浴中放置5 min”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含膽酸的濃度，計算，即得。結(jié)果表明膽酸含量為5.20～75.16 mg/mL。按最低含量的90%計算，建議膽汁中總膽汁酸含量以膽酸計不得低于4.68mg/mL。（見表3）

2.9 膽汁發(fā)酵南星方法 2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定膽南星的原料為制天南星細粉和牛膽汁、羊膽汁、豬膽汁，或為生天南星細粉與牛膽汁、羊膽汁、豬膽汁[7]。本試驗選擇后者，設計以傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)為基礎(chǔ)，對天南星和虎掌南星分別進行發(fā)酵，按照2020年版《中華人民共和國藥典》對成品進行鑒別，從而評價膽汁樣品質(zhì)量。膽南星發(fā)酵工藝如下：將天南星、虎掌南星冷水泡至透心，切薄片，60 ℃烘干制成粗粉，加入2%酵母粉、40%牛膽汁混勻，置淺盤中平鋪，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，溫度32 ℃，濕度75%，發(fā)酵至表面長滿菌絲，取出，隔水蒸1～2 h，取出，切塊，置60 ℃烘箱中烘干，取出，制成粗粉，重復發(fā)酵2次，烘干即得膽南星成品。

2.9.1 性狀鑒別 膽南星成品為不規(guī)則塊狀，棕黑色，質(zhì)硬，氣微腥，味苦。

2.9.2 顯微鑒別 膽南星粉末呈淡黃棕色，水合氯醛透化片可見類圓形薄壁細胞，內(nèi)部充滿糊化淀粉粒；草酸鈣針晶束、螺紋導管和環(huán)紋導管多見。（見圖7）

圖7 膽南星粉末顯微鑒別特征圖 （×400）

2.9.3 理化鑒別 取成品粉末各0.2 g，加水5 mL，搖勻，濾過，取濾液2 mL置試管中，加新制1%糠醛水溶液0.5 mL，沿管壁加硫酸2 mL，兩液接界處即顯棕紅色環(huán)。

3 討論

對于中藥炮制輔料用牛膽汁的來源，目前在各地方標準、規(guī)范中規(guī)定不同，且在國家標準中也無統(tǒng)一規(guī)定。在飲片炮制中，常因地取材。目前牛膽汁的主要來源為?？苿游稂S牛Bos taurus domesticus Gmelin或水牛Bubalus bubalis L.的膽汁。有文獻報道[15-16]指出，黃牛和水牛的膽汁化學成分指紋特征極其相似，其相對含量差異甚微。本試驗收集了15批黃牛膽汁進行質(zhì)量標準研究，具有一定的代表性。膽汁的性狀是根據(jù)收集到的樣品實際情況，進行觀察與描述，與其他省份性狀描述大體一致。膽汁多為棕黃色或黃綠色，少部分牛膽汁為綠褐色或暗褐色；棕黃色或棕褐色的牛膽汁較黏稠，其試驗結(jié)果顯示無水乙醇浸出物和有效成分膽酸的含量較高。此外，由于膽汁作為中藥炮制輔料直接以液體形式入藥，用于中藥飲片的膽汁制，以達到使某些中藥“減毒增效”的目的。因此，在制訂其輔料標準時，不再單獨規(guī)定其性味與歸經(jīng)、功能與主治。

本試驗重點研究了膽汁的鑒別、檢查與含量測定項。使用專屬性較強的薄層色譜法分別對膽汁進行薄層鑒別，對辨別膽汁的來源有重要意義。有文獻研究[17-18]表明，新鮮膽汁制得的膽粉中主要含結(jié)合型膽汁酸類成分，如?；悄懰?、甘氨膽酸，僅有少量的膽酸和去氧膽酸成分，故增加膽粉對照藥材作為對照顯然較合適?！哆|寧省中藥材標準第二冊（2019年版）》中探索牛膽汁的薄層鑒別方法表明去氧膽酸的斑點只在剛剛顯色時可以見到，放置后變?yōu)槟：磺寤蛳В虼吮狙芯窟x用膽酸對照品和?；悄懰徕c對照品作為參照來鑒別樣品的真?zhèn)巍Ｔ跈z查項中，設定的具體檢查項目有“牛膽汁中的豬膽汁”“相對密度”“異性有機物”“水分”的檢查，可有效控制膽汁的摻假現(xiàn)象。

膽汁中所含膽汁酸類成分的含量和種類較多，膽酸是其主要活性成分之一[19]。測定膽汁中膽酸含量的方法有紫外-可見分光光度法、比色法、薄層色譜掃描法、HPLC-UV、HPLCELSD、液質(zhì)聯(lián)用法等[20-23]。但由于不同動物膽汁中膽酸的存在方式不同，故本試驗采用較為簡便、快速的紫外-可見分光光度法測定其總膽酸的含量，進行方法學驗證，結(jié)果證明該方法可行，可信度好。3種膽汁所含膽酸含量差別較大，以牛膽汁最多、羊膽汁次之、豬膽汁最少，為古人多用牛膽汁這一做法提供一定的科學依據(jù)。結(jié)合本研究結(jié)果，建議在膽汁中藥炮制輔料來源分級研究時將牛膽汁作為一級，豬膽汁、羊膽汁可作為統(tǒng)貨或再細分為二級、三級。關(guān)于膽汁作為中藥炮制輔料的用法用量，《中華人民共和國藥典》和各省市中藥飲片炮制規(guī)范中的規(guī)定均不統(tǒng)一。本試驗參考相關(guān)資料結(jié)合課題組研究經(jīng)驗采用發(fā)酵工藝制備膽南星，發(fā)酵原料選擇《中華人民共和國藥典》規(guī)定原料天南星和虎掌南星，發(fā)酵原料配比為1∶1.2，周期為19 d。經(jīng)檢驗，成品質(zhì)量符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，表明膽汁樣品質(zhì)量合格。