亞乎奴萜類和生物堿類化學(xué)成分研究

潘如意，孫彥君*，陳豪杰，李 孟，司盈盈，馮衛(wèi)生*

亞乎奴萜類和生物堿類化學(xué)成分研究

潘如意1, 2, 3，孫彥君1, 2, 3*，陳豪杰1, 2，李 孟1, 2，司盈盈1, 2，馮衛(wèi)生1, 2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 河南 鄭州 450046 3. 河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046

研究亞乎奴var.的萜類和生物堿類化學(xué)成分。采用硅膠、Sephadex LH-20、ODS、MCI等柱色譜和半制備液相色譜對其化學(xué)成分進行分離純化，通過MS、NMR等波譜分析技術(shù)，結(jié)合理化性質(zhì)分析，鑒定化合物結(jié)構(gòu)。采用MTS法，測試化合物1、2、4、6～9、13、14對人急性早幼粒白血病HL-60細胞、人肺癌A549細胞、人肝癌SMMC-7721細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人結(jié)腸癌SW480細胞的細胞毒性。從亞乎奴95%乙醇提取物中分離得到15個化合物，分別鑒定為羽扇豆醇（1）、白樺脂醇（2）、3β,14-二羥基-14β-孕甾-5-烯-20-酮（3）、3β-羥基-l7β-孕甾-5-烯-7,20-二酮（4）、假虎刺酮（5）、脫氫地芰普內(nèi)酯（6）、黑麥草內(nèi)酯（7）、(＋)-去氫催吐蘿芙木醇（8）、(3,5,6,7)-3,5,6-三羥基-7-巨豆烯-9-酮（9）、(6,7,9)-9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮（10）、催吐蘿芙木醇（11）、8,9-二氫-8,9-二羥基巨豆三烯酮（12）、橙黃胡椒酰胺乙酸酯（13）、橙黃胡椒酰胺（14）、橙黃胡椒酰胺苯甲酸酯（15）。MTS測試結(jié)果顯示，化合物2對A549細胞和SMMC-7721細胞具有一定的細胞毒活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為23.62、27.46 μmol/L。所有化合物均為首次從錫生藤屬植物中分離得到，包括三萜類化合物4個（1～4）、單萜類化合物8個（5～12）、生物堿類化合物3個（13～15）。羽扇豆烷型三萜可能為亞乎奴藥材抗腫瘤活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

亞乎奴；萜類化合物；細胞毒活性；羽扇豆烷型三萜；白樺脂醇；橙黃胡椒酰胺

亞乎奴為防己科植物錫生藤var.(Buch. ex DC.) Forman的干燥全株，為傣族習(xí)用藥材，具有消腫止痛，止血，生肌之功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，亞乎奴具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗蛇毒等作用[2-3]。目前，已從該植物中發(fā)現(xiàn)了生物堿、黃酮、萜類、甾體、小分子酚酸等類型化學(xué)成分[4]，關(guān)于其化學(xué)成分的研究多集中于生物堿，為進一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)利用提供理論依據(jù)，本課題組對亞乎奴95%乙醇提取物的中的生物堿和萜類化合物進行研究，共分離鑒定了15個化合物，分別為羽扇豆醇（lupeol，1）、白樺脂醇（betulin，2）、3β,14-二羥基-14β-孕甾-5-烯-20-酮（3β,14-dihydroxy- 14β-pregn-5-en-20-one，3）、3β-羥基-l7β-孕甾-5-烯- 7,20-二酮（3β-hydroxy-l7β-pregn-5-ene-7,20-dione，4）、假虎刺酮（carissone，5）、脫氫地芰普內(nèi)酯（dehydrololiolide，6）、黑麥草內(nèi)酯（loliolide，7）、(＋)-去氫催吐蘿芙木醇（dehydrovomifoliol，8）、(3,5,6,7)-3,5,6-三羥基-7-巨豆烯-9-酮 [(3,5, 6,7)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one，9]、(6,7,9)-9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮 [(6,7,9)-9- hydroxy-4,7-megastigmadien-3-one，10]、催吐蘿芙木醇（vomifoliol，11）、8,9-二氫-8,9-二羥基巨豆三烯酮（8,9-dihydro-8,9-dihydroxymegastigmatrienone，12）、橙黃胡椒酰胺乙酸酯（aurantiamide acetate，13）、橙黃胡椒酰胺（aurantiamide，14）、橙黃胡椒酰胺苯甲酸酯（aurantiamide benzoate，15）。所有化合物均為首次從錫生藤屬植物中分離得到。采用MTS法，對化合物1、2、4、6～9、13、14進行了體外細胞毒活性評價，結(jié)果顯示化合物2對人肺癌細胞A549和人肝癌細胞SMMC-7721細胞顯示一定的細胞毒活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為23.62、27.46 μmol/L。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE Ⅲ 500型核磁共振儀（德國Bruker公司）；Bruker maxis HD型飛行時間質(zhì)譜（德國Bruker公司）；制備型高效液相色譜儀（北京賽譜銳思科技有限公司）；N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DFZ-3型真空干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech公司）；ODS（100 μm，YMC）；MCI Gel CHP-20（日本三菱化學(xué)）；甲醇，色譜純（天津市四友精細化學(xué)品有限公司）；MTS（美國Promega公司）；其他試劑均為分析級。

人急性早幼粒白血病HL-60細胞株、人肺癌A549細胞株、人肝癌SMMC-7721細胞株、人乳腺癌MCF-7細胞株、人結(jié)腸癌SW480細胞株均購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

亞乎奴藥材采集于云南，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠明教授鑒定為錫生藤屬植物錫生藤var.(Buch. ex DC.) Forman的干燥全株。

2 提取與分離

取干燥的亞乎奴藥材50.66 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，減壓濃縮得總浸膏2 736.5 g。用蒸餾水混懸，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，得到石油醚萃取部位（351.1 g）、氯仿萃取部位（740.1 g）、正丁醇萃取部位（594.5 g）及水萃取部位（562.8 g）。

將氯仿萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮（100∶0～1∶2）梯度洗脫得到5個組分Fr. C1～C5。組分Fr. C2經(jīng)硅膠柱色譜分離后，重結(jié)晶得到化合物1（10 mg）。組分Fr. C3經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（100∶0～100∶50）梯度洗脫，得到7個亞組分Fr. C3-1～C3-7。亞組分Fr.C3-3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜[二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫] 分離，得到Fr. C3-3-1～C3-3-5。Fr.C3-3-4經(jīng)ODS柱色譜分離，以甲醇-水（30%、50%、70%、73%、76%、79%、82%、85%、90%、100%）梯度洗脫，得到10個組分Fr. C3-3-4-1～C3-3-4-10。組分Fr. C3-3-4-1經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯梯度（100∶0～100∶50）梯度洗脫，得到組分Fr. C3-3-4-1-3，再經(jīng)制備型高效液相色譜（23%乙腈）分離，得到化合物5（3.6 mg，R＝45.7 min）、6（11.2 mg，R＝43.5 min）。組分Fr. C3-3-4-8經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（100∶0～100∶30）洗脫，得到化合物2（5.6 mg）。Fr.C3-4經(jīng)MCI柱色譜分離，甲醇-水（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）洗脫，得到9個亞組分Fr. C3-4-1～C3-4-9。亞組分Fr. C3-4-3經(jīng)制備型高效液相色譜（43%甲醇）分離，得到化合物8（16 mg，R＝23.0 min）。亞組分Fr.C3-4-4以經(jīng)制備型高效液相色譜（53%甲醇）分離，得到化合物9（3 mg，R＝26.0 min）、10（3.5 mg，R=32.4 min）。組分Fr. C4經(jīng)MCI柱色譜分離，以甲醇-水（10%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%）梯度洗脫，得到8個亞組分Fr.C4-1～Fr.C4-6。經(jīng)薄層色譜檢識，將Fr.C4-1經(jīng)硅膠柱色譜分離，用石油醚-丙酮（100∶0～1∶2）梯度洗脫，得到5個亞組分Fr. C4-1-1～C4-1-5。Fr.C4-1-3經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（50∶1～1∶2）洗脫，得到組分Fr. C4-1-3-1～C4-1-3-4。Fr. C4-1-3-2經(jīng)制備型高效液相色譜（37%甲醇，6 mL/min）分離，得到化合物7（3.0 mg，R＝40.1 min）。亞組分Fr. C4-1-4用Sephadex LH-20柱色譜分離，以甲醇洗脫，得到Fr. C4-1-4-1～C4-1-4-3。Fr. C4-1-4-2經(jīng)制備型高效液相色譜分離，第1次用35%甲醇（R＝32.9 min）洗脫，第2次用25%乙腈（6 mL/min）制備得到化合物11（17 mg，R＝27.4 min）、12（3.3 mg，R＝40.5 min）。組分Fr. C4-2經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇洗脫）柱色譜分離，得到6個亞組分Fr. C4-2-1～C4-2-6。亞組分Fr. C4-2-2經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（80∶1～10∶1）梯度洗脫，得到5個組分Fr. C4-2-2-1～C4-2-2-5，組分Fr. C4-2-2-1經(jīng)制備型高效液相色譜（52%乙腈，6 mL/min）分離，得到化合物3（4.5 mg，R＝34.8 min）、4（3.6 mg，R＝21.2 min）。組分Fr. C4-3經(jīng)硅膠柱色譜分離，用石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶2）梯度洗脫，得到5個亞組分Fr. C4-3-1～C4-3-5。Fr. C4-3-3經(jīng)制備型高效液相色譜（50%乙腈，6 mL/min）分離，得到化合物14（7.4 mg，R＝40.2 min）。組分Fr. C4-4經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶2）梯度洗脫，得到5個亞組分Fr. C4-4-1～C4-4-4。亞組分Fr. C4-4-3通過重結(jié)晶，得到化合物13（30 mg）。組分Fr. C4-5經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶2，純甲醇）梯度洗脫，得到3個亞組分Fr. C4-5-1～C4-5-3。亞組分Fr. C4-5-2經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇洗脫）分離，得到5個組分Fr. C4-5-2-1～C4-5-2-5。Fr. C4-5-2-2經(jīng)制備型高效液相色譜（75%甲醇，6 mL/min）分離，得到化合物15（19 mg，R＝44.8 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 3.45 (1H, m, H-3), 2.47 (1H, dd,= 16.1, 10.5 Hz, H-19), 1.02 (3H, s, H-23), 0.87 (3H, s, H-24), 0.96 (3H, s, H-25), 1.23 (3H, s, H-26), 1.04 (3H, s, H-27), 0.81 (3H, s, H-28), 4.87 (1H, brs, H-29a), 4.72 (1H, brs, H-29b), 1.73 (3H, s, H-30)；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 39.1 (C-1), 27.6 (C-2), 77.9 (C-3), 39.3 (C-4), 55.6 (C-5), 18.6 (C-6), 34.5 (C-7), 40.9 (C-8), 50.5 (C-9), 37.3 (C-10), 20.9 (C-11), 25.3 (C-12), 38.1 (C-13), 42.8 (C-14), 27.6 (C-15), 35.6 (C-16), 43.0 (C-17), 48.0 (C-18), 48.4 (C-19), 150.8 (C-20), 29.9 (C-21), 40.0 (C-22), 28.1 (C-23), 16.1 (C-24), 16.2 (C-25), 16.0 (C-26), 14.5 (C-27), 18.0 (C-28), 109.7 (C-29), 19.2 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[5]，故鑒定化合物1為羽扇豆醇。

化合物2：白色針晶（二氯甲烷）。mp 236～238 ℃。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 3.45 (1H, dd,= 8.0, 1.5 Hz, H-3), 0.95 (3H, s, H-23), 0.81 (3H, s, H-24), 0.86 (3H, s, H-25), 1.01 (3H, s, H-26), 1.03 (3H, s, H-27), 4.47 (2H, m, H-28), 5.49 (1H, brs, H-29a), 5.11 (1H, brs, H-29b), 1.22 (3H, s, H-30)；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 40.8 (C-1), 29.1 (C-2), 79.4 (C-3), 40.6 (C-4), 57.1 (C-5), 20.0 (C-6), 39.6 (C-7), 41.4 (C-8), 52.0 (C-9), 37.0 (C-10), 22.4 (C-11), 28.2 (C-12), 38.7 (C-13), 42.4 (C-14), 29.6 (C-15), 31.3 (C-16), 44.3 (C-17), 50.2 (C-18), 44.5 (C-19), 157.8 (C-20), 33.4 (C-21), 36.0 (C-22), 30.0 (C-23), 17.5 (C-24), 17.7 (C-25), 17.6 (C-26), 16.0 (C-27), 65.5 (C-28), 107.5 (C-29), 19.2 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[6]，故鑒定化合物2為白樺酯醇。

化合物3：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.25 (1H, m, H-1a), 1.73 (1H, m, H-1b), 3.42 (1H, m, H-3), 5.41 (1H, m, H-6), 1.81 (1H, m, H-8), 1.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-11a), 2.04 (1H, m, H-11b), 1.31 (1H, m, H-12a), 1.23 (1H, m, H-12b), 1.92 (1H, m, H-15a), 1.81 (1H, m, H-15b), 1.92 (2H, m, H-16), 3.00 (1H, dd,= 9.5, 4.5 Hz, H-17), 1.01 (3H, s, H-18), 1.04 (3H, s, H-19), 2.27 (3H, s, H-21)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 38.5 (C-1), 32.2 (C-2), 72.3 (C-3), 42.8 (C-4), 141.0 (C-5), 122.7 (C-6), 28.3 (C-7), 37.8 (C-8), 47.4 (C-9), 38.1 (C-10), 21.8 (C-11), 39.6 (C-12), 50.2 (C-13), 86.9 (C-14), 35.1 (C-15), 25.2 (C-16), 63.8 (C-17), 15.5 (C-18), 19.9 (C-19), 219.1 (C-20), 32.2 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[7]，故鑒定化合物3為3β,14-二羥基-14β-孕甾-5-烯-20-酮。

化合物4：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.27 (1H, t,= 11.3 Hz, H-1a), 1.70 (1H, overlapped, H-1b), 3.69 (1H, m, H-3), 2.56-2.37 (2H, overlapped, H-4), 5.72 (1H, s, H-6), 1.81-1.51 (1H, overlapped, H-8), 1.50～1.33 (2H, overlapped, H-16), 2.05 (1H, m, H-11a), 1.81-1.51 (1H, overlapped, H-11b), 1.50～1.33 (2H, overlapped, H-12), 1.97 (1H, m, H-15a), 1.81～1.51 (1H, overlapped, H-15b), 1.81～1.51 (1H, overlapped, H-9), 2.05 (1H, dd,= 12.6, 3.4 Hz, H-17), 0.66 (3H, s, H-18), 1.21 (3H, s, H-19), 2.13 (3H, s, H-21)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 36.4 (C-1), 31.1 (C-2), 70.5 (C-3), 41.8 (C-4), 165.4 (C-5), 125.9 (C-6), 201.5 (C-7), 45.2 (C-8), 49.8 (C-9), 38.3 (C-10), 21.1 (C-11), 37.7 (C-12), 44.4 (C-13), 50.0 (C-14), 26.5 (C-15), 23.6 (C-16), 62.3 (C-17), 13.3 (C-18), 17.3 (C-19), 209.7 (C-20), 31.6 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[8]，故鑒定化合物4為3β-羥基-l7β-孕甾-5-烯-7,20-二酮。

化合物5：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.55 (1H, ddd,= 17.0, 11.7, 8.1 Hz, H-2a), 2.33 (1H, overlapped, H-2b), 1.89 (1H, overlapped, H-6a), 2.92 (1H, m, overlapped, H-6b), 1.28 (6H, s, H-12, 13), 1.75 (3H, d,= 1.1 Hz, H-14), 1.20 (3H, s, H-15)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 37.2 (C-1), 34.6 (C-2), 201.5 (C-3), 129.5 (C-4), 166.4 (C-5), 30.0 (C-6), 51.2 (C-7), 22.7 (C-8), 43.3 (C-9), 35.1 (C-10), 10.9 (C-11), 73.0 (C-12), 26.2 (C-13), 27.5 (C-14), 22.7 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[9]，故鑒定化合物5為假虎刺酮。

化合物6：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.90 (1H, dd,= 13.7, 1.8Hz, H-2a), 2.83 (1H, d,= 13.7 Hz, H-2b), 2.58 (1H, d,= 14.4 Hz, H-4a), 2.48 (1H, dd,= 14.4, 1.8 Hz, H-4b), 6.07 (1H, s, H-7), 1.32 (3H, s, H-9), 1.44 (3H, s, H-10), 1.60 (3H, s, H-11)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 36.7 (C-1), 54.8 (C-2), 206.8 (C-3), 53.7 (C-4), 87.9 (C-5), 173.3 (C-6), 115.3 (C-7), 181.0 (C-8), 27.2 (C-9), 29.9 (C-10), 26.2 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[10]，故鑒定化合物6為脫氫地芰普內(nèi)酯。

化合物7：無色結(jié)晶（甲醇）。mp 152～153 ℃。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.01 (1H, dt,= 14.4, 2.6 Hz, H-2a), 1.55 (1H, dd,= 14.4, 3.6 Hz, H-2b), 4.23 (1H, m, H-3), 2.45 (1H, dt,= 13.8, 2.4 Hz, H-4a), 1.76 (1H, dd,= 14.4, 3.6 Hz, H-4b), 5.77 (1H, s, H-7), 1.48 (3H, s, H-9), 1.29 (3H, s, H-10), 1.78 (3H, s, H-11)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 37.2 (C-1), 48.0 (C-2), 67.2 (C-3), 46.3 (C-4), 88.9 (C-5), 174.4 (C-6), 113.3 (C-7), 185.7 (C-8), 27.0 (C-9), 27.4 (C-10), 30.0 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物7為黑麥草內(nèi)酯。

化合物8：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.62 (1H, d,= 17.2 Hz, H-2a), 2.29 (1H, d,= 17.2 Hz, H-2b), 5.95 (1H, s, H-4), 7.01 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.45 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 2.32 (3H, s, H-10), 1.08 (3H, s, H-11), 1.04 (3H, s, H-12), 1.92 (3H, d,= 1.2 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 42.6 (C-1), 50.5 (C-2), 200.3 (CO), 128.0 (C-4), 164.6 (C-5), 80.0 (C-6), 148.3 (C-7), 131.7 (C-8), 200.6 (CO), 27.6 (C-10), 23.5 (C-11), 24.7 (C-12), 19.1 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物8為(＋)-去氫催吐蘿芙木醇。

化合物9：無色油狀物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 1.29(1H, m, H-2a), 1.60 (1H, m, H-2b), 3.78 (1H, m, H-3), 1.67 (4H, dd,= 14.3, 9.2 Hz, H-4a), 2.29 (1H, m, H-4b), 6.20 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7), 7.18 (1H, d,= 15.8 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-10), 1.20 (3H, s, H-11), 0.98 (3H, s, H-12), 1.21 (3H, s, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 36.1 (C-1), 47.6 (C-2), 64.4 (C-3), 41.3 (C-4), 68.8 (C-5), 70.8 (C-6), 145.4 (C-7), 133.8 (C-8), 200.2 (CO), 25.1 (C-10), 29.8 (C-11), 27.4 (C-12), 20.0 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物9為(3,5,6,7)-3,5,6-三羥基-7-巨豆烯-9-酮。

化合物10：無色油狀物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.42 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2a), 2.07 (1H, d,= 16.7 Hz, H-2b), 5.90 (1H, s, H-4), 2.68 (1H, d,= 9.1 Hz, H-6), 5.60 (1H, dd,= 16.0, 9.2 Hz, H-7), 5.72 (1H, dd,= 15.3, 5.8 Hz, H-8), 4.29 (1H, m, H-9), 1.26 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.05 (3H, s, H-11), 1.01 (3H, s, H-12), 1.94 (3H, s, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 37.1 (C-1), 48.4 (C-2), 202.0 (C-3), 127.2 (C-4), 166.0 (C-5), 56.7 (C-6), 126.1 (C-7), 140.2 (C-8), 68.8 (C-9), 23.8 (C-10), 27.3 (C-11), 28.0 (C-12), 23.7 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物10為(6,7,9)-9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮。

化合物11：無色油狀物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.54 (1H, d,= 17.0 Hz, H-2a), 2.18 (1H, t,= 16.6 Hz, H-2b), 5.90 (1H, s, H-4), 5.79 (1H, d,= 15.7 Hz, H-7), 5.83 (1H, d,= 15.7 Hz, H-8), 4.34 (1H, m, H-9), 1.26 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.03 (3H, s, H-11), 1.06 (3H, s, H-12), 1.94 (3H, s, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 42.4 (C-1), 50.7 (C-2), 201.3 (CO), 127.1 (C-4), 167.4 (C-5), 80.0 (C-6), 130.1 (C-7), 136.9 (C-8), 68.7 (C-9), 23.8 (C-10), 24.5 (C-11), 23.5 (C-12), 19.6 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物11為催吐蘿芙木醇。

化合物12：無色油狀物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.41 (1H, d,= 16.0 Hz, H-2a), 2.34 (1H, d,= 16.0 Hz, H-2b), 5.96 (1H, s, H-4), 6.01 (1H, d,= 9.8 Hz, H-7), 4.62 (1H, dd,= 9.8, 5.6 Hz, H-8), 3.69 (1H, m, H-9), 1.18 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.32 (3H, s, H-11), 1.40 (3H, s, H-12), 2.13 (3H, d,= 0.8 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 40.0 (C-1), 54.4 (C-2), 201.8 (C-3), 127.3 (C-4), 158.8 (C-5), 145.1 (C-6), 135.2 (C-7), 72.5 (C-8), 71.3 (C-9), 19.4 (C-10), 30.0 (C-11), 29.9 (C-12), 22.7 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物12為8,9-二氫-8,9-二羥基巨豆三烯酮。

化合物13：白色針晶（二氯甲烷）。mp 186～188 ℃。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 4.78 (1H, dd,= 14.0, 7.9 Hz, H-2), 3.22 (1H, dd,= 13.6, 5.9 Hz, H-3a), 3.07 (1H, dd,= 13.6, 8.4 Hz, H-3b), 7.25 (5H, m, H-5～9), 7.71 (2H, d,= 7.6 Hz, H-3′, 7′), 7.44 (2H, t,= 7.6 Hz, H-4′, 6′), 7.52 (1H, t,= 7.4 Hz, H-5′), 4.34 (1H, m, H-1′′), 2.75 (2H, m, H-2′′), 7.07 (2H, d,= 6.9 Hz, H-4′′, 8′′), 7.15 (3H, m, overlapped, H-5′′, 6′′, 7′′), 3.93 (1H, dd,= 11.3, 4.9 Hz, H-9′′a), 3.82 (1H, dd,= 11.3, 4.2 Hz, H-9′′b), 2.01 (3H, s, COCH3), 6.17 (1H, d,= 6.8 Hz, α-NH), 6.85 (1H, d,= 6.8 Hz, β-NH)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 170.3 (C-1), 55.0 (C-2), 38.5 (C-3), 136.7 (C-4), 128.7 (C-5, 9), 129.3 (C-6, 8), 127.1 (C-7), 167.1 (C-1′), 133.6 (C-2′), 128.6 (C-3′, 7′, 4′′, 8′′), 127.1 (C-4′, 6′), 131.9 (C-5′), 49.4 (C-1′′), 37.1 (C-2′′), 136.6 (C-3′′), 129.1 (C-5′′, 7′′), 126.7 (C-6′′), 64.6 (C-9′′), 20.8 (COCH3), 170.8 (COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物13為橙黃胡椒酰胺乙酸酯。

化合物14：白色針晶（二氯甲烷）。mp 180～182 ℃。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 4.78 (1H, dd,= 8.9, 6.2 Hz, H-2), 3.15 (1H, dd,= 13.8, 6.1 Hz, H-3a), 2.94 (1H, dd,= 13.8, 6.1 Hz, H-3b), 7.25 (5H, m, H-5～9), 7.69 (2H, d,= 7.3 Hz, H-3′, 7′), 7.43 (2H, t,= 7.3 Hz, H-4′, 6′), 7.52 (1H, t,= 7.4 Hz, H-5′), 4.07 (1H, dd,= 11.2, 5.6 Hz, H-1′′), 2.94 (1H, dd,= 13.8, 7.5 Hz, H-2′′a), 2.71 (1H, dd,= 13.6, 8.2 Hz, H-2′′b), 7.17 (5H, m, H-4′′～8′′), 3.42 (2H, m, H-9′′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 173.3 (C-1), 56.6 (C-2), 38.8 (C-3), 139.6 (C-4), 129.3 (C-5, 9), 130.4 (C-6, 8), 127.7 (C-7), 170.0 (C-1′), 135.3 (C-2′), 129.4 (C-3′, 7′), 128.5 (C-4′, 6′), 132.8 (C-5′), 54.4 (C-1′′), 37.9 (C-2′′), 138.6 (C-3′′), 130.4 (C-4′′, 8′′), 129.5 (C-5′′, 7′′), 127.3 (C-6′′), 63.9 (C-9′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16-17]，故鑒定化合物14為橙黃胡椒酰胺。

化合物15：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 4.79 (1H, dd,= 9.4, 5.8 Hz, H-2), 3.13 (1H, m, H-3a), 2.89 (1H, m, H-3b), 7.21 (5H, m, H-5～9), 7.68 (2H, overlapped, H-3′, 7′), 7.48 (2H, overlapped, H-4′, 6′), 7.36 (1H, overlapped, H-5′), 4.13 (1H, dd,= 11.2, 6.3 Hz, H-1′′), 7.21 (5H, m, H-4′′～8′′), 3.27 (2H, overlapped, H-9′′), 7.68 (2H, overlapped, H-3′′′, 7′′′), 7.48 (2H, overlapped, H-4′′′, 6′′′), 7.36 (1H, overlapped, H-5′′′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 170.3 (C-1), 56.3 (C-2), 37.9 (C-3), 135.7 (C-4), 126.8～127.0 (C-5～9), 173.1 (C-1′), 134.4 (C-2′), 127.6 (C-3′, 7′), 128.5 (C-4′, 6′), 132.6 (C-5′), 51.9 (C-1′′), 38.0 (C-2′′), 138.6 (C-3′′), 126.8-127.0 (C-4′′～8′′), 66.8 (C-9′′), 170.3 (C-1′′′), 134.4 (C-2′′′), 127.6 (C-3′′′, 7′′′), 128.5 (C-4′′′, 6′′′), 132.5 (C-5′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物15為橙黃胡椒酰胺苯甲酸酯。

4 細胞毒活性評價

以順鉑為陽性對照藥，將100 μL的腫瘤細胞（人急性早幼粒白血病HL-60細胞、人肺癌A549細胞、人肝癌SMMC-7721細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人結(jié)腸癌SW480細胞）接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。將待測化合物（1、2、4、6～9、13、14）以40、8、1.6、0.32和0.064 μmol/L的濃度加入，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，向每個孔中加入MTS（20 μL），并在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在492 nm處測量吸光度。待測化合物對腫瘤細胞細胞毒活性的IC50值用Reed-Muench方法計算。結(jié)果顯示，化合物2對人肺癌A549細胞和人肝癌SMMC-7721細胞顯示一定的細胞毒活性，IC50值為（23.62±1.63）和（27.46±0.87）μmol/L，其余化合物IC50均大于50 μmol/L。

5 討論

本實驗運用多種色譜分離技術(shù)對錫生藤屬植物亞乎奴的化學(xué)成分進行分離純化，得到15個化合物（1～15），包括三萜類化合物4個（1～4）、單萜類化合物8個（5～12）、生物堿類化合物3個（13～15），首次在錫生藤屬植物中發(fā)現(xiàn)了單萜類和酰胺類生物堿的存在，對防己科錫生藤屬植物與其他屬植物的植物化學(xué)分類學(xué)研究具有重要的指導(dǎo)意義。

對化合物1、2、4、6～9、13、14進行了腫瘤細胞毒活性的測定，測試結(jié)果顯示所供試化合物中，化合物2對A549細胞和SMMC-7721細胞具有一定的細胞毒活性，提示本藥材可能具有抗腫瘤活性，羽扇豆烷型三萜類化合物可能是亞乎奴發(fā)揮其抗腫瘤活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。從亞乎奴中分離得到的3個酰胺類生物堿結(jié)構(gòu)新穎獨特，文獻報道具有抗炎活性[19-20]，鑒于傣藥亞乎奴臨床上用于消腫止痛，提示酰胺類生物堿可能是亞乎奴發(fā)揮抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，但具體的作用機制還需要進一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Terpenoids and alkaloids fromvar.

PAN Ru-yi1, 2, 3, SUN Yan-jun1, 2, 3, CHEN Hao-jie1, 2, LI Meng1, 2, SI Ying-ying1, 2, FENG Wei-sheng1, 2

1. Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine and Respiratory Diseases by Henan & Education Ministry of China, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 3. Henan Research Center for Special Processing Technology of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To study the terpenoids and alkaloids fromvar..The compounds were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20, ODS, MCI column chromatography and preparative HPLC, and their structures were identified by physicochemical properties, NMR and MS. Compounds 1, 2, 4, 6—9, 13 and 14 were tested for their cytotoxicity in human liver cancer SMMC-7721, breast cancer MCF-7, leukemia HL-60, lung cancer A549, colon cancer SW480 cell lines by MTS.Fifteen compounds were isolated from the 95% ethanol extract ofvar., and their structures were identified as lupeol (1), betulin (2), 3β,14-dihydroxy-14β-pregn-5-en-20-one (3), 3β-hydroxy-l7β-pregn-5- ene-7,20-dione (4), carissone (5), dehydrololiolide (6), loliolide (7), dehydrovomifoliol (8), (3,5,6,7)-3,5,6-trihydroxy- 7-megastigmen-9-one (9), (6,7,9)-9-hydroxy-4,7-megastigmadien-3-one (10), vomifoliol (11), 8,9-dihydro-8,9- dihydroxymegastigmatrienone (12), aurantiamide acetate (13), aurantiamide (14), and aurantiamide benzoate (15). Compound 2 showed the most potent cytotoxic activities against the A549 and SMMC-7721 cell lines, with IC50values of 23.62 and 27.46 μmol/L, respectively.All compounds are isolated fromgenus for the first time, including four triterpenoids (1～4), eight monoterpenoids (5～12) and three alkaloids (13～15). Lupane triterpenoids may be antitumor constituents fromvar..

var.(Buch.ex DC.) Forman; terpenoids; cytotoxic; lupane triterpenoids; betulin; aurantiamide

R284.1

A

0253 - 2670(2022)18 - 5607 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.003

2021-04-26

河南中醫(yī)藥大學(xué)省屬高校基本科研業(yè)務(wù)專項（2014KYYWF-QN26）；河南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新人才（2016XCXRC01）；河南省科技攻關(guān)（192102310438）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項（20-21ZY1039）

潘如意（1998—），女（漢族），碩士研究生，從事天然抗腫瘤活性物質(zhì)研究。Tel: 18837138537 E-mail: 18837138537@163.com

孫彥君（1978—），女（漢族），教授，碩士生導(dǎo)師，從事天然抗腫瘤活性物質(zhì)研究。Tel: (0371)65962746 E-mail: sunyanjunily@126.com

馮衛(wèi)生（1960—），男（漢族），教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥活性成分研究。Tel: (0371)60190296 E-mail: fwsh@hactcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]