基于高效液相色譜法對淡豆豉發酵過程中6種異黃酮含量的動態分析

曹冬英，謝思靜，曾思婷，隋利強，徐偉（福建中醫藥大學藥學院，福建省中藥炮制技術傳承基地，福州350122）

淡豆豉，又名“香豉”“豆豉”“豉”，為豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟種子（黑豆）的發酵加工品[1]。其味苦、辛，性涼，歸肺、胃經，有解表、除煩、宣發郁熱的作用，在臨床上主要用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等癥[2]。

淡豆豉歷代炮制方法有燒制、熬制、炒制、清酒制、醋蒸制、炒焦法、鹽醋拌蒸法以及清蒸法等[3-6]。2020年版的《中國藥典》收載的淡豆豉發酵方法為青蒿、桑葉加水煎煮，煎液拌入大豆，大豆吸汁后蒸透，晾涼，再用青蒿、桑葉渣悶制使發酵至黃衣上遍，除去藥渣之后再進行悶制直到香氣溢出，再略蒸，干燥即得淡豆豉成品[1]。

淡豆豉在不同地區炮制方法略有差異，《全國中藥炮制經驗與規范集成》（2017年版增修本）[7]中一共收載了42 種關于淡豆豉的炮制方法，其中24 種方法是直接發酵不經過悶制，18 種方法經過發酵后再悶制。《全國中藥飲片炮制規范輯要》（2016年版）[8]中則收載了20 種淡豆豉的炮制方法，其中，直接發酵和經過發酵后再悶制的方法各10 種。關于淡豆豉發酵過程中再悶制工藝合理性與否也存在爭議。

淡豆豉中含有黃酮類、多糖類、豆豉纖溶酶、大豆皂苷、蛋白質等成分，其中異黃酮具有預防更年期、乳腺癌以及改善骨質疏松，預防心血管疾病、阿爾茨海默病等藥理活性[9]，并且在淡豆豉中主要以游離型的苷元和結合型的糖苷存在，故本文主要通過收集淡豆豉不同發酵階段的樣品，通過HPLC 法測定6 種異黃酮的含量，分析不同發酵階段6 種異黃酮含量動態變化，探討發酵過程中再悶制環節的必要性，為淡豆豉的工藝和原理研究提供理論參考。

1 材料

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SQP 型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；大豆苷（批號：P14M10F83057）、大豆苷元（批號：C06N6Y5504）、黃豆黃苷（批號：P06J9F65073）、黃豆黃素（批號：G16J9C65571）、染料木苷（批號：P09M8F31018）、染料木素（批號：H30A9Z69019）（上海源葉生物科技有限公司，以上對照品純度均大于98%）；甲醇為色譜純（德國Merck 公司）；甲酸為色譜純（上海阿拉丁試劑有限公司）。

黑豆（市售），經福建中醫藥大學車蘇容副教授鑒定為豆科植物黑大豆Glycine max（L.）Merr.的成熟種子。桑葉（北京本草方源藥業集團有限公司，批號：20170508）經福建中醫藥大學車蘇容副教授鑒定為桑科植物桑Morus alba（L.）的葉。青蒿（安徽順和堂中藥飲片有限公司，批號：171201）經福建中醫藥大學車蘇容副教授鑒定為菊科植物黃花蒿Artemisia annua（L.）的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 淡豆豉樣品的制備[1]

黑大豆洗凈，取青蒿、桑葉加水煎煮，紗布過濾，濾渣備用，煎液濃縮，冷卻拌入凈大豆，藥汁吸盡后蒸透，取出，晾涼。置容器內，紗布覆蓋，濾過的青蒿、桑葉渣均勻覆蓋于紗布上，置于室溫，悶制發酵，于發酵第2日、第4日、第6日、第13日分別取出部分黑豆留作淡豆豉樣品，并標記為Y-2、Y-4、Y-6、Y-13。

取發酵后的淡豆豉清洗稍晾，置于密閉容器內水浴50 ～60℃，保溫，進行第二次悶制發酵，分別在第二次發酵的第3日、第9日和第15日分別取出部分黑豆留作淡豆豉樣品，并標記為Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15。

取Y-2、Y-4、Y-6、Y-13、Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15 共7 份樣品，干燥，粉碎，過二號篩。

2.2 色譜條件[10-11]

采用Welch Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-甲酸0.1%（B）為流動相，梯度洗脫（0 ～7 min，25%～30%A；7 ～12 min，30% ～45%A；12 ～20 min，45%A；20 ～27 min，45% ～60%A；27 ～33 min，60% ～75%A；33 ～35 min，75%～25%A；35 ～40 min，25%A），流速為0.8 mL·min－1，柱溫為30℃，檢測波長為254 nm。理論塔板數均不低于5000。樣品和對照品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 對照品及淡豆豉樣品HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance and Sojae Seman Praeparatum sample

2.3 混合對照品溶液的制備

取對照品大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素適量，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加入70%甲醇超聲溶解，制成質量濃度分別為730、1200、916、608、892 和564 μg·mL－1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品儲備液各1 mL，置同一10 mL 量瓶中，加70%甲醇至刻度混勻，得到質量濃度為大豆苷73 μg·mL－1、大豆苷元120 μg·mL－1、黃豆黃苷91.6 μg·mL－1、黃豆黃素60.8 μg·mL－1、染料木苷89.2 μg·mL－1、染料木素56.4 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

依次取樣品粉末（過二號篩）約1 g，精密稱定，分別置于50 mL 錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用70%色譜甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液至進樣瓶中備用。

2.5 標準曲線的制備

精密稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素各對照品，加入70%甲醇超聲溶解，定容至5 mL 量瓶，再用70%甲醇稀釋為不同梯度質量濃度的混合對照品溶液。按“2.2”項下的色譜條件測定。以大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素的質量濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，見表1。

表1 淡豆豉中6 種異黃酮的線性范圍考察結果Tab 1 Linear range of 6 isoflavones in Sojae Seman Praeparatum

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下的混合對照品溶液10 μL，按照“2.2”項下的色譜條件連續進樣6 次測定，測得大豆苷元、大豆苷、黃豆黃素、黃豆黃苷、染料木素、染料木苷的峰面積RSD分別為0.078%、0.062%、0.042%、0.23%、0.039%、2.5%。說明精密度良好。

2.7 重復性試驗

稱取淡豆豉粉末，按“2.4”項下的方法制備成供試品溶液，按照“2.2”項下的色譜條件進樣6 次，計算得大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素峰面積的RSD分別為3.0%、0.47%、2.6%、1.2%、2.8%、2.4%，結果表明方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

精密稱取編號為Y悶-15 的淡豆豉粉末，按“2.4”項下的方法制備成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按照“2.2”項下的色譜條件進樣測定，計算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素峰面積的RSD值分別為2.8%、1.9%、1.2%、0.71%、1.4%、1.2%。表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.9 加樣回收試驗

取編號為Y悶-15 的淡豆豉粉末，精密稱定約1 g，每份加入等量的6 份混合對照品溶液，按照“2.4”項下的方法制備供試品溶液，再按照“2.2”項下的色譜條件進樣測定，計算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素的平均加樣回收率為103.66%、99.51%、101.40%、99.44%、103.89%、101.76%；RSD分別為3.7%、2.5%、3.7%、3.6%、3.3%、3.3%。

2.10 樣品的含量測定

取編號為Y-2、Y-4、Y-6、Y-13、Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15 的淡豆豉粉末樣品，精密稱取1 g，分別置于50 mL 錐形瓶中，再分別精密加入70%色譜甲醇25 mL，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用70%色譜甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液至進樣瓶中，按照“2.2”項下的方法進樣測定，代入回歸方程計算出每份樣品中6 種異黃酮的濃度以及6 種異黃酮的含量，結果見表2，用折線統計圖表示6 種異黃酮含量動態變化，見圖2。

表2 淡豆豉不同發酵階段6 種異黃酮的含量(n ＝3)Tab 2 Content of 6 isoflavones in different fermentation stages of Sojae Seman Praeparatum (n ＝3)

圖2 淡豆豉不同發酵階段6 種異黃酮含量動態變化趨勢圖Fig 2 Dynamic change of 6 isoflavones in different fermentation stages of Sojae Seman Praeparatum

3 討論

3.1 悶制過程中主要成分含量變化

由圖2 可直觀看出，淡豆豉發酵過程中，大豆苷元、染料木素和黃豆黃素3 種苷元含量總體呈上升趨勢，以大豆苷元的變化趨勢最顯著；染料木苷、大豆苷和黃豆黃苷3 種苷含量總體呈下降趨勢，以染料木苷的下降趨勢最顯著。

大豆苷元從發酵開始，含量變化上升顯著，第二次悶制的第3日含量上升最顯著；染料木素在第一次悶制發酵階段前6 d 含量變化不大，第13日含量有明顯上升趨勢；黃豆黃素在第一次悶制發酵的前4 d 含量增加最為顯著，此3 種苷元都是第二次悶制發酵階段第9日含量達到峰值，到第二次悶制發酵階段第15日含量有所下降，提示第二次悶制發酵階段對于苷元含量的積累有顯著影響，可嘗試縮短悶制時間。染料木苷從發酵開始，含量持續下降，并且下降幅度最大；大豆苷在發酵第4日含量下降幅度最大，此后含量呈較緩下降趨勢；黃豆黃苷在發酵前6 d 含量下降不大，第13日有明顯下降趨勢。此3 種苷類成分的含量都是第二次悶制發酵階段第9日達到最低值，但在第15日都有所上升。結果提示，在淡豆豉發酵過程中存在苷到苷元的轉化并且第二次悶制發酵的過程中苷和苷元會持續轉化。

大豆苷具有良好的降血壓和改善腦循環的作用；大豆苷元具有類雌激素樣作用[12]，對于治療婦女更年期綜合征等具有良好效果；黃豆黃苷具有抗病毒、抗菌的作用[13]，可以防止骨質疏松和心腦血管疾病；黃豆黃素除了能夠降低胃癌細胞的存活率[14]，還可以誘發細胞程序性死亡；染料木苷具有抗增殖、抗腫瘤血管生成，以及誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡等作用[15]；染料木素具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡等活性[16]。再悶制階段有利于苷向苷元轉化，該過程主要由于葡萄糖苷酶作用于糖苷型異黃酮的氧苷鍵，使其葡萄糖基團脫掉，供微生物代謝，使糖苷型異黃酮轉化為異黃酮苷元。因大豆苷元、染料木素等異黃酮苷元較糖苷型異黃酮具有更高的生物活性[17]，所以淡豆豉發酵后解表、除煩功效增強。

3.2 提取溶劑的優化

在前期試驗的基礎上，結合參考文獻，對淡豆豉中6 種異黃酮的提取溶劑進行了優化，比較了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇的提取效果。結果顯示，70%甲醇提取效果較好，且雜質相對較少，故本試驗采用70%甲醇作為提取溶劑。

3.3 小結

淡豆豉在不同地區炮制方法略有差異，對于發酵過程的悶制環節是否必要，不同學者也持有不同見解，本試驗收集淡豆豉不同發酵階段的樣品，分析6 種異黃酮含量動態變化，結果顯示，淡豆豉發酵過程中存在苷到苷元的轉化現象，再悶制環節有利于苷轉化成苷元，并且大豆苷元、染料木素等異黃酮苷元較糖苷型異黃酮具有更高的生物活性。該結果提示，淡豆豉發酵過程再悶制是必要過程，是有利于藥效成分轉化的發酵階段。后期試驗可結合不同階段解表、除煩作用的研究，對再悶制過程的必要性進一步分析探討，結合淡豆豉發酵過程中藥理作用的變化，為淡豆豉炮制工藝和炮制原理研究提供參考。