隱秘小環藻無菌化處理研究?

張 裕，劉 雨，朱葆華，李 赟，潘克厚,2??

(1.海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

自然環境或實驗室條件下，微藻與細菌關系密切。在微藻生長過程中，有些細菌不僅能夠促進藻類生長，誘導微藻活性物質的產生，還有助于絮凝[1-4]，還有些細菌能產生鼠李糖脂或胞外絲氨酸蛋白酶，這些活性物質具有對赤潮藻類的殺藻作用[5-6]。因此，研究細菌對藻類生長及代謝的影響，對于優化藻類的培養技術及藻類產品的開發、應用具有重要意義，而進行微藻無菌化處理是獲得微藻無菌培養物，開展微藻相關細菌功能研究的前提，也是實現微藻兼養、異養培養的基礎。

因微藻種類及培養條件不同，微藻相關細菌組成也具有種間特異性。微藻無菌化方法既包括渦流、超聲波處理[7-8]、密度梯度離心、連續稀釋[9]和紫外線照射[10]等物理方法，也包括抗生素處理[11]、溶菌酶處理[12]及抗菌物質處理[13]等化學方法。而最常用的方法是抗生素法[4]。由于每種抗生素都有其特定的作用方式和靶細胞，因此了解微藻種類及其相關菌群結構，有助于選擇合適的抗生素組合進行除菌，成功獲得無菌藻株[14]。

隱秘小環藻(Cyclotellacryptica)作為一種廣鹽性海洋硅藻[15-16]，其脂質含量可達總生物量的42%，其中TAG含量占總脂含量的55%左右[17]，已被證明是一種良好的脂質生產者[18]。除了可進行傳統的自養生長外，隱秘小環藻還能以葡萄糖為碳源進行異養生長[19-21]。與很多硅藻相似，隱秘小環藻也具有納米級到微米級的多孔結構，具有良好的止血、藥物緩釋能力[22-24]。這顯示出隱秘小環藻具有非常廣闊的綜合利用前景。

本研究探究了不同抗生素對隱秘小環藻藻液中細菌的抑制效果及對微藻生長的影響，同時對比分析了抗生素處理前后藻液細菌群落結構，進而設計了有效的抗生素組合進行隱秘小環藻的無菌化處理，為隱秘小環藻的培養方式優化以及藻際細菌功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養條件

本研究的實驗藻種——隱秘小環藻(Cyclotellacryptica)由中國海洋大學應用微藻生物學實驗室種質庫提供(編號LAMB 147)。微藻培養基采用f/2培養液，固體培養基追加1%的瓊脂。海水經0.22 μm濾膜過濾，加入f/2母液，高溫滅菌冷卻后使用。原藻種長期保存于低溫液體培養基中，先進行涂板挑取單藻落進行活化，再將活化后的藻種用于后續實驗。培養溫度為22 ℃，光照強度為40 μmol·m-2·s-1，光照周期(光∶暗)為12 h∶12 h。

1.2 實驗試劑

實驗所用抗生素均購自北京索萊寶科技有限公司，實驗開始前配制抗生素母液，其中硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素母液濃度為50 mg·mL-1；鹽酸環丙沙星母液濃度為25 mg·mL-1。抗生素母液經0.22 μm微孔過濾器過濾后，置于-20 ℃冷凍保存。實驗所用細菌培養基為2216E固體培養基及2216E液體培養基，均購自海博生物有限公司。

1.3 除菌抗生素種類及濃度的確定

1.3.1 藻液中細菌對不同抗生素的敏感性 選取硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素6種抗生素。將母液進行稀釋，使各抗生素終濃度為200、400、600和800 μg·mL-1，將直徑為6 mm的濾紙片浸泡在相應濃度的抗生素中，置于37 ℃恒溫培養箱烘干備用。取100 μL處于指數生長期的藻液，稀釋后涂布于2216E固體培養基，分別將含有不同濃度抗生素的濾紙片平貼在培養基上，各濃度抗生素做3個平行。置于37 ℃恒溫培養箱倒置培養48 h，觀察并測量抑菌圈大小。選擇對藻液中細菌抑制作用強的抗生素作為除菌工具。

1.3.2 藻細胞對不同抗生素的耐受性比較 取適量處于指數生長期的藻液接種于120 mL新鮮滅菌f/2培養基中，初始OD750為0.050。分別向培養基中添加上述6種抗生素，使其終濃度分別為200、400、600和800 μg·mL-1，并以不添加抗生素(0 μg·mL-1)作為對照，實驗組和對照組分別設置3個平行。培養方式同1.1，連續培養7 d，每天定點搖藻，并隨機變換位置。每隔48 h取1 mL藻液，利用血球計數板進行計數測定細胞密度。后續補充實驗中鹽酸環丙沙星的作用終濃度分別為25、50、75和100 μg·mL-1，處理方式同上。根據不同抗生素對隱秘小環藻生長的影響，選擇對微藻毒害作用小的抗生素種類及濃度用于后續除菌。

1.4 單一抗生素除菌后藻液細菌多樣性及群落結構分析

取適量處于指數生長期的藻液接種于120 mL新鮮滅菌f/2培養基，分別使用800 μg·mL-1氨芐青霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素以及600 μg·mL-1的硫酸新霉素和600 μg·mL-1硫酸慶大霉素處理3 d，以不加抗生素的藻液作為對照組，實驗組和對照組分別設置3個平行。處理結束后各取藻液50 mL，用0.22 μm的濾膜過濾，富集黏附細菌及游離細菌。將各處理組的3個平行混合作為一個樣品，并分別對樣品進行編號。將樣品送至聯川生物有限公司進行16S rRNA基因高通量測序，比較抗生素處理及未處理隱秘小環藻藻液細菌多樣性及群落結構變化。

采用CTAB法提取樣品總DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA提取質量，并使用紫外分光光度計檢測總DNA的濃度和純度。以樣品DNA為模板，選擇細菌16S rRNA基因V3～V4區引物序列341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’),進行PCR擴增，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用AMPure XT beads純化試劑盒進行純化。將純化的擴增產物進行文庫構建，檢測合格后，使用Illumina NovaSeq高通量測序平臺進行雙端測序。

首先將測序獲得的原始序列使用cutadapt軟件去除引物序列和平衡堿基序列；使用FLASH軟件將每對Pair-end reads進行拼接；使用fqtrim軟件進行過濾質控，去除低質量序列；使用Vsearch軟件去除嵌合體序列；使用Qiime2軟件去噪，獲得ASV(Feature)特征序列和ASV(Feature)豐度表。利用Qiime 2軟件計算樣品Alpha多樣性指數，包括Observed OTUs、Shannon、Simpson和Chao1。根據獲得的ASV(Feature)特征序列，使用SILVA數據庫(Release 138)以及NT-16S數據庫進行物種注釋，并根據ASV(Feature)豐度表對各物種在各樣本中豐度進行統計。

1.5 抗生素組合除菌

首先，使用600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素抗生素組合進行除菌。但這一組合處理后仍殘留少量細菌，在對殘留細菌進行分離鑒定基礎上，追加對殘留細菌有明顯抑制作用的鹽酸環丙沙星進行有針對性的除菌處理。

隨后，采用2種組合方式進行除菌。組合一：將處于指數生長期的藻液接種于新鮮無菌培養基，同時添加600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素和25 μg·mL-1鹽酸環丙沙星聯合處理3 d。組合二：將處于指數生長期的藻液接種于新鮮無菌培養基，先添加600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素聯合處理3 d，離心洗滌后重新接種于新鮮滅菌培養基，培養3 d后，再次離心洗滌，接種于新鮮培養基，追加25 μg·mL-1的鹽酸環丙沙星處理3 d。

1.6 無菌效果檢驗

在每種抗生素組合處理結束時進行無菌檢驗。另外，將除菌后微藻轉入不含抗生素的無菌培養基中傳代培養3次后(各代培養7 d)再次進行無菌檢驗。檢驗方式為平板培養法和熒光染色觀察法[11]。其中平板培養法中一種方式是取藻液100 μL涂布于2216E固體培養基，培養數天后觀察有無菌落出現；另一種方式是取適量藻液接種于改進f/2液體培養基，即在原f/2培養基基礎上添加5 g·L-1蛋白胨和1 g·L-1酵母膏，置于適宜條件下培養5 d后，再次進行涂板檢驗，觀察有無菌落出現。熒光染色觀察法是取100 μL藻液，加入0.1 μL SYBR Green Ⅰ進行染色，觀察染色情況。兩種方法均以未經抗生素處理的藻細胞作對照。

1.7 帶菌藻株和無菌藻株的生長比較

無菌隱秘小環藻在不含抗生素的f/2培養基中傳代培養5次(各代培養7 d)后用于生長比較實驗。將處于指數生長期的無菌和帶菌隱秘小環藻按1.833×105cells·mL-1的初始密度分別接種于120 mL新鮮f/2培養基，每組設置3個平行。培養條件下同1.1，培養周期為8 d，每天定點取1 mL藻液，采用血球計數板法計數藻細胞密度。

1.8 統計分析

本研究將3組平行的實驗數據均用于結果分析，計算平均值及標準差，用Origin軟件進行數據整理并作圖，采用SPSS軟件對數據進行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性水平為p<0.05。

2 結果

2.1 除菌抗生素種類及濃度

2.1.1 不同抗生素對藻液中細菌的抑制效果 以抑菌圈大于20 mm作為抗生素具有顯著抑菌效果的判斷標準，由表1可以看出，4個實驗濃度的氨芐青霉素、濃度不小于400 μg·mL-1的氯霉素以及濃度為800 μg·mL-1的硫酸慶大霉素抑菌效果均十分顯著，而濃度低于800 μg·mL-1的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素及濃度為200 μg·mL-1的硫酸新霉素抑菌效果均較差。

表1 不同種類及濃度抗生素對隱秘小環藻藻液中細菌的抑制效果Table 1 The inhibitory effects of different types and concentrations of antibiotics on bacteria in algae liquid of Cyclotella cryptica

2.1.2 不同抗生素對隱秘小環藻生長的影響 不同濃度的硫酸慶大霉素、硫酸新霉素、硫酸卡鏈霉素及硫酸卡那霉素均能促進隱秘小環藻生長(見圖1 A～D)。其中600 μg·mL-1的硫酸慶大霉素和硫酸新霉素以及800 μg·mL-1硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素對隱秘小環藻的生長促進作用最明顯，培養至第7天時，藻細胞密度約為對照組的1.4～1.6倍。各濃度的氨芐青霉素對隱秘小環藻均無抑制作用，各處理組與對照組的藻細胞密度無顯著差異(p>0.05)(見圖1 E)。隱秘小環藻對氯霉素極其敏感，當濃度為200 μg·mL-1時，就能顯著抑制其生長，隨著濃度升高，抑制程度也增強，培養至第5天時，藻液變白，藻細胞死亡(見圖1F)。

隱秘小環藻對鹽酸環丙沙星的耐受性實驗結果顯示(見圖1 G)，在實驗濃度范圍內，隨著濃度升高、時間延長，鹽酸環丙沙星對隱秘小環藻的抑制效果越來越顯著。培養至第3天時，濃度為25 μg·mL-1的鹽酸環丙沙星處理組，藻細胞密度為4.175×105cells·mL-1，比對照組降低了3.8%左右，培養至第7天時，藻細胞密度比對照組降低了16.4%左右。綜合考慮，在用鹽酸環丙沙星除菌時，建議使用濃度25 μg·mL-1的鹽酸環丙沙星處理3 d。

2.2 單一抗生素除菌后藻液細菌多樣性及群落結構

根據上述實驗結果，最終確定分別使用600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、600 μg·mL-1硫酸新霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素和800 μg·mL-1氨芐青霉素進行除菌。抗生素處理前后藻液細菌多樣性指數比較結果顯示(見表2)，與未經抗生素處理相比，各抗生素處理后各項指數均下降，這說明抗生素處理后藻液中細菌多樣性和細菌豐富度均降低。

表2 單一抗生素處理前后隱秘小環藻藻液中細菌群落α-多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of the bacteria communities in algae liquid of Cyclotella cryptica before and after single antibiotic treatment

具體分析各處理組的細菌群落結構，結果顯示不同抗生素處理的細菌群落組成明顯不同。對照組中隱秘小環藻的優勢菌門為Proteobacteria(變形菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)，其相對豐度分別為43.87%、30.22%和25.40%(見圖2 A)。抗生素處理后，各處理組優勢菌門均為Cyanobacteria(藍細菌門)，其豐度由原來的0.21%增加至66.02%～87.08%，變形菌門細菌相對豐度在5.90%～20.29%之間；浮霉菌門細菌相對豐度在0.95%～5.80%之間；擬桿菌門細菌相對豐度在4.05%～8.27%之間。原優勢菌群相對豐度均顯著降低。

具體到屬水平上(見圖2 B)，對照組中Roseimaritima(玫瑰菌屬)、Marinibacterium(海桿菌屬)、Muricauda(鼠尾菌屬)、Halomonas(鹽單胞菌屬)和Alii-diomarina是隱秘小環藻藻液中5個優勢菌屬，占總細菌的97%以上。而在抗生素處理后，藍細菌門的Oxyphotobacteria_unclassified則成為占比最高的細菌屬，豐度最低的氨芐青霉素處理組為66.02%，最高的硫酸鏈霉素處理組為87.08%。抗生素處理后Aliidio-marina相對豐度也顯著增加，以氨芐青霉素處理組的變化最為顯著，由對照組的1.33%增加至13.40%。而Marinibacterium、Roseimaritima、Muricauda、Halomonas四個原有的優勢屬在抗生素處理后相對豐度均降低。氨芐青霉素處理組Marinibacterium相對豐度僅為0.22%，顯著低于其他處理組。硫酸卡那霉素處理組和硫酸慶大霉素處理組中Roseimaritima相對豐度最低，分別由對照組的30.20%降低至0.95%和0.99%。硫酸鏈霉素處理組和硫酸卡那霉素處理組中的Muricauda相對豐度分別為4%和4.34%，也顯著低于其他處理組。氨芐青霉素處理組中的Halomonas相對豐度為5.82%，其他處理組該屬細菌的相對豐度在0.6%～0.7%，均顯著低于對照組。結果表明，不同抗生素抑菌能力存在明顯的種屬差異性。

2.3 抗生素組合的除菌效果及分析

根據單一抗生素處理前后藻液細菌多樣性及菌群結構變化情況，選擇對隱秘小環藻藻液中優勢菌抑菌作用最顯著的硫酸慶大霉素(600 μg·mL-1)、硫酸卡那霉素(800 μg·mL-1)和硫酸鏈霉素(800 μg·mL-1)組合進行除菌。3種抗生素組合處理后，涂板檢驗仍存在少量細菌，經鑒定均為擬桿菌門的Muricaudasp.。針對Muricaudasp.，又追加對該菌具有顯著抑制作用的鹽酸環丙沙星來進行處理。

首先，同時添加4種抗生素除菌后，經涂板檢驗，平板上未出現細菌。SYBR Green Ⅰ染色結果顯示無細菌。但除菌后的隱秘小環藻無法傳代培養，接種到新鮮無菌培養基后藻液變白，藻細胞死亡。說明這一組合除菌方式對藻細胞的抑制作用強，不適用于隱秘小環藻的無菌化處理。

隨后，采用先添加3種抗生素除菌，離心洗滌除去抗生素，重新接種到新鮮培養基，再添加鹽酸環丙沙星除菌，經涂板檢驗無細菌生長，而未處理的對照組平板上出現大量細菌(見圖3)。SYBR Green Ⅰ染色20 min，在熒光顯微鏡下未觀察到被染色的細菌。除菌后的隱秘小環藻多次傳代培養后也未觀察到細菌(見圖4)。這表明該抗生素組合除菌方式用于隱秘小環藻的無菌化處理是可行的。

2.4 帶菌藻株和無菌藻株的生長情況

連續培養初始細胞密度相同的帶菌藻株和無菌藻株8 d，與帶菌藻株相比，無菌隱秘小環藻培養液中藻細胞懸浮性較好，而帶菌藻株培養液中藻細胞容易沉底。2種培養液的藻細胞密度均呈現相似的增長趨勢(見圖5)，但無菌藻株細胞密度總是低于帶菌藻株，培養至第8天，帶菌藻株的細胞密度為1.117×106cells·mL-1，無菌藻株的細胞密度為9.333×105cells·mL-1，無菌藻株比帶菌藻株的生長量低16.4%左右。

3 討論

抗生素法作為一種常用的除菌方式被廣泛應用于實驗室條件下微藻的無菌化處理，利用抗生素除菌的關鍵是選擇對微藻毒害作用小且能有效除菌的抗生素。本研究比較了6種常用抗生素對隱秘小環藻生長的影響以及對藻液中細菌的抑制效果，發現氯霉素嚴重抑制隱秘小環藻的生長，除氯霉素和氨芐青霉素外，其他抗生素均能促進隱秘小環藻生長。在實驗濃度范圍內，藻液中細菌對濃度為600～800 μg·mL-1的抗生素敏感。Cao等[25]研究表明，抗生素的添加對微藻生長的促進作用與微藻培養液中有害菌被抑制有關，且500 μg·mL-1氨芐青霉素能夠改善球等鞭金藻的光合活性，從而促進其生長。在Zhong等[26]的研究中，高濃度抗生素會降低藻細胞的葉綠素a含量，同時使藻細胞中活性氧水平快速增加，這是導致微藻生長受到抑制的重要原因。某些抗生素對微藻的影響還具有雙重性，例如，高濃度(5～100 μg·L-1)的阿奇霉素會削弱蛋白核小球藻的光合活性，造成氧化損傷，抑制生長，而低濃度時(0.5和1 μg·L-1)反而會刺激小球藻生長[27]。青霉素在500 μg·mL-1時會抑制普通小球藻和蛋白核小球藻生長[28]，而本研究中800 μg·mL-1的氨芐青霉素對隱秘小環藻無影響。由此可見，除菌抗生素種類及濃度與微藻種類密切相關。

本研究根據微藻對不同抗生素的耐受性實驗以及藥敏實驗，確定了除菌抗生素種類及作用濃度，并對抗生素處理前后藻液細菌多樣性及群落結構進行對比分析，發現與未經抗生素處理相比，抗生素處理后藻液中細菌OTU數量大幅減少且細菌多樣性降低，且不同抗生素對隱秘小環藻藻液中細菌的抑制效果存在種屬的特異性。如硫酸鏈霉素能降低隱秘小環藻中擬桿菌門細菌Muricauda的相對豐度，硫酸卡那霉素對浮霉菌門細菌Roseimaritima的抑制作用最強，硫酸慶大霉素能抑制大部分變形菌門細菌，如Marinibacterium、Halomonas、Aliidiomarina。以上3種抗生素對隱秘小環藻的優勢菌具有很好的抑制效果。

在微藻無菌化過程中，抗生素組合除菌通常比單種抗生素除菌效果更佳。Su等[29]采用了慶大霉素、鏈霉素、頭孢菌素(各100 μg·mL-1)和利福平(10 μg·mL-1)的抗生素組合進行除菌，成功獲得了塔瑪亞歷山大藻的無菌培養物。本研究首先選擇硫酸慶大霉素(600 μg·mL-1)、硫酸卡那霉素(800 μg·mL-1)和硫酸鏈霉素(800 μg·mL-1)的抗生素組合用于隱秘小環藻的無菌化處理。結果發現無論采用單種抗生素逐一添加還是3種抗生素同時添加的方式，無菌檢驗后總有Muricauda屬細菌存在。鑒于該屬細菌對環丙沙星敏感[30]，故后續除菌時追加25 μg·mL-1鹽酸環丙沙星。但是同時添加4種抗生素除菌并未獲得無菌藻株，實驗過程中藻細胞逐漸變白直至死亡。考慮到同時添加4種抗生素對藻細胞造成了嚴重損傷，本研究首先用600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素和800 μg·mL-1硫酸鏈霉素的抗生素組合除菌后，收集藻細胞并用無菌水沖洗數次，以消除存留的抗生素，再追加鹽酸環丙沙星除菌，最終獲得了隱秘小環藻的無菌藻株。以上結果說明，在使用抗生素進行微藻的無菌化處理時，抗生素的添加方式也是成功獲得無菌藻株的重要因素。

除菌后的隱秘小環藻進行多次傳代培養，排除抗生素的影響，比較其生長情況，結果顯示與帶菌藻株相比，無菌藻株的生長速率較低，培養8 d的細胞密度要顯著低于未除菌對照組。這與Scholz等[8]研究結果一致，未除菌的Naviculapalpebralis生長速度比無菌藻株高29%。這表明抗生素處理在除去抑制藻類生長細菌的同時可能也殺死了部分能夠促進藻類生長的有益菌。這些有益菌通過分泌植物激素或將有機營養物礦化為無機物的方式促進藻類生長[31-32]。關于隱秘小環藻相關細菌對微藻生長的影響還需通過菌藻共培養進行深入研究。