鱘魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物濾池的水質(zhì)變化及微生物群落結(jié)構(gòu)響應(yīng)?

陳 奇,宋協(xié)法??,周廣軍，薛致勇

(1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003；2.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264034；3.海陽市黃海水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 265122)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)穩(wěn)定運行期間生物濾池中硝化細菌的數(shù)量是動態(tài)變化的，但影響其時空分布的主要環(huán)境因子目前尚未明確。本研究以雜交鱘(施氏鱘Acipenserschrenckii♀×西伯利亞鱘Acipenserbaerii♂)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的四級生物濾池為研究對象，運用16S rRNA高通量測序手段研究微生物的群落結(jié)構(gòu)、種群穩(wěn)定性以及功能菌在生物濾池中所起的作用。探究循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池中微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物群落對水質(zhì)變化的響應(yīng)及生物濾池的運行參數(shù)，為鱘魚及其他名貴魚類的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池的設(shè)計與運行提供技術(shù)支撐和理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)

實驗系統(tǒng)位于山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司7號養(yǎng)殖車間，整個系統(tǒng)由9個養(yǎng)殖池(養(yǎng)殖面積50 m2，有效水深1 m)、轉(zhuǎn)鼓式微濾機、生物濾池、充氧池和紫外線殺菌消毒裝置等組成。養(yǎng)殖用水鹽度13，日補充水量約占總水量的15%，循環(huán)率為8次/d。生物濾池分為四級(1～4級生物濾池)，其中2級為MBBR，生物濾料為比表面積600 m2/m3的多孔塑料環(huán)，其余3級為固定床，生物濾料為比表面積316 m2/m3的立體彈性填料，均采用自然掛膜。

2019年6月開始鱘魚養(yǎng)殖，初始養(yǎng)殖密度為42.5 kg/m3，鱘魚平均體長為(74.58±4.24)cm、平均體質(zhì)量為(3.87±0.56)kg，魚體健康狀況良好。養(yǎng)殖過程中投喂鱘魚專用顆粒飼料(升索牌G8餌料，粗蛋白含量44%)，每天投餌2次，時間為7:30和16:30，日投喂量為魚體質(zhì)量的0.36%。

1.2 水質(zhì)檢測方法

實驗期間，每5天測定1次各級生物濾池進、出水水質(zhì)。水溫、溶解氧、pH采用YSI多參數(shù)水質(zhì)分析儀于現(xiàn)場檢測；總氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮、化學(xué)需氧量等指標(biāo)在實驗室根據(jù)《海洋監(jiān)測規(guī)范第4部分：海水分析》(GB17378.4—2007)操作規(guī)范進行檢測，每個指標(biāo)測定3次,結(jié)果取平均值。

1.3 樣品采集和高通量測序

將四級生物濾池按水流方向依次標(biāo)為A～D，并在實驗第1、11、21、31、41天分別從4個濾池中以五點取樣法剪取濾料樣品，混合樣品約15 g分別放入編號A～D的50 mL取樣管中[8]，加40 mL無菌水后放入-80 ℃冰箱中保存，并將樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Illumina-MiSeq平臺上進行測序分析。

1.4 分析方法

使用Microsoft Excel和SPSS 26.0軟件對各級生物濾池的水質(zhì)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和單因素方差分析。根據(jù)Index序列區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù)，將其以fasta格式保存，利用Qiime(version 1.9.1)對數(shù)據(jù)進行檢測并去除嵌合體序列[9]。利用Uparse軟件(version 7.0.1090)按照97%相似性進行OTUs聚類(不含單序列)，形成OTUs列表[10]。用RDP Classifier(version 2.11)對OTUs代表序列進行比對分析，在不同分類學(xué)水平上注釋其群落的物種信息[11]。基于OTU聚類的結(jié)果，利用R語言工具計算Shannon和Chao1指數(shù)[12]，對微生物群落與測定的各環(huán)境理化指標(biāo)進行主成份分析(PCA)和冗余分析(RDA)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 四級生物濾池水處理性能及分析

實驗期間，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)運行穩(wěn)定，四級生物濾池進、出水的水質(zhì)參數(shù)如表1所示，生物濾池進、出水的總氨氮濃度、COD濃度存在顯著性差異(P<0.05)，水溫18.2 ℃、溶解氧6.24 mg/L、pH 7.0。總氨氮、亞硝態(tài)氮和化學(xué)需氧量的去除率為60.23%、15.56%和33.77%。生物濾池總進水與1、2、3級生物濾池出水的總氨氮濃度依次顯著降低(P<0.05)，說明前3級生物濾池對氨氮去除效果明顯；相反，3級生物濾池出水和生物濾池總出水總氨氮濃度相差不大，即4級生物濾池的氨氮去除率較差；而2級生物濾池出水COD濃度顯著低于1級生物濾池出水COD濃度(P<0.05)，說明COD的去除主要發(fā)生在2級生物濾池。

2.1.1 總氨氮(TAN)去除率變化 生物濾池總進水的TAN濃度為 0.209～0.369 mg/L，總出水的TAN濃度為0.047～0.164 mg/L，TAN總?cè)コ势骄鶠?0.23%(見圖1)，生物濾池可有效去除養(yǎng)殖水中的氨氮，且水質(zhì)穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。其中，1級生物濾池的TAN去除率為21.65%，占總?cè)コ实?6.81%；2級生物濾池的TAN去除率為24.74%，占總?cè)コ实?1.21%；3級生物濾池的TAN去除率為26.80%;占總?cè)コ实?6.00%；4級生物濾池的TAN去除率為9.5%，占總?cè)コ实?.98%。1、2、3級生物濾池對TAN的去除率顯著高于4級生物濾池(P<0.05，見表2)，4級生物濾池對TAN去除效果不明顯。

表1 各級生物濾池進、出水的水質(zhì)參數(shù)Table 1 Water quality parameters of inlet and outlet water at all levels of biological filter

表2 各級生物濾池去除率Table 2 Removal rate of various biological filters %

2.1.4 COD去除率變化 生物濾池總進、出水的COD濃度存在顯著性差異(P<0.05，見表1)，總進水的COD濃度為2.43～4.43 mg/L，出水的COD為1.39～2.88 mg/L，去除率為33.77%。試驗期間COD去除率變化如圖4所示。其中，1級生物濾池的COD去除率為-1.21%，2級生物濾池的COD去除率為25.18%，3級生物濾池的COD去除率為-11.49%，4級生物濾池的COD去除率為18.59%。2、4級生物濾池的COD去除率顯著高于1、3級生物濾池(P<0.05，見表2)，2、4級生物濾池的COD去除效果更明顯。

2.2 生物濾池微生物群落多樣性變化

2.2.1微生物群落多樣性指數(shù)變化 20個生物膜樣品均得到原始序列數(shù)和多樣性指數(shù)(見表3)，樣本覆蓋率(Coverage)為100%。通過比較5個時間點生物濾池的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，第3個時間點整個生物濾池平均Shannon指數(shù)為5.650，高于其他4個時期。微生物群落豐富度和多樣性在第3、4、5個時間點時依次降低。

表3 微生物群落多樣性指數(shù)Table 3 Microbial community diversity index

續(xù)表3

2.2.2 微生物群落組成變化 20個生物膜樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成相似(見圖5)，微生物主要隸屬于37個門，561個屬，926個種，其優(yōu)勢菌為變形菌門(Proteobacteria,19.4%～38.1%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,10.6%～27.3%)、綠彎菌門(Chloroflex，10.7%～21.1%)、浮霉菌門(Planctomycetes，3.9%～30.9%)、疣微菌門(Verrucomicrobiota，1.0%～12.1%)，其組成分布在門水平上與先前報道的結(jié)果相似[14-16]。

優(yōu)勢菌屬(見圖6)分別為：norank_f__AKYG1722(4.11%～9.31%)、unclassified_f__Rhodobacteraceae(3.21%～8.85%)、norank_f__Saprospiraceae(3.25%～9.63%)、norank_f__Caldilineaceae(0.97%～7.90%)、unclassified_f__Flavobacteriaceae(1.10%～6.81%)、unclassified_k__norank_d__Bacteria(0.87%～4.66%)、浮霉菌屬(Planctomicrobium，0.048%～16.50%)。它們分別屬于AKYG1722科、紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、暖繩菌科(Caldilineaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)等。在生物濾池中起硝化作用的主要細菌是氨氧化細菌和亞硝化細菌[17]，此生物濾池中的相關(guān)細菌有硝化螺旋菌屬(Nitrospira,0.037%～1.43%)和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas，0.054%～0.21%)細菌。其中，硝化螺旋菌屬在時間上相對豐度顯著性降低(見圖7)，雖然這些菌屬的豐度不高，但其是水處理過程中起十分重要作用的功能性細菌[18]。

2.2.3 不同時期微生物群落的相似性分析 OTU(Operational taxonomic unit)水平PCA分析(見圖8)所示，兩軸的總貢獻率為67.99%。其中，主坐標(biāo)1的方差貢獻率為47.40%，主坐標(biāo)2的方差貢獻率為20.59%。在空間上，1、3、4級生物濾池各樣本點之間的相似度較高，與2級生物濾池樣本點之間相似度較低，說明1、3、4級生物濾池中微生物群落有更高的相似性；在時間上，2級生物濾池3個時間點(B1、B2、B3)的相似度較高，與B4、B5之間相似度較低。結(jié)果表明，不同樣品的微生物群落差異較大，即各級生物濾池中不同時期的微生物群落差異較大。

2.3 微生物群落組成與水環(huán)境因子的響應(yīng)分析

3 討論

4 結(jié)論

(1)本實驗發(fā)現(xiàn)生物濾池對總氨氮、亞硝酸鹽和化學(xué)需氧量的去除率分別達到60.23%、15.56%和33.77%，整個過程對亞硝酸氮去除不明顯。其中，4級生物濾池進、出水的總氨氮、亞硝酸鹽和COD濃度相差不大，相較于前3級生物濾池對氨氮的去除效果不明顯，其可能存在功能上的浪費。

(2)通過高通量測序，本次實驗生物濾池中微生物隸屬于37個門，100個綱，240個目，369個科和561個屬的細菌，其主要為變形菌門、綠彎菌門和擬桿菌門。1、3、4級生物濾池的微生物群落組成相似，且在時間、空間尺度上存在動態(tài)變化。

(3)受生物濾池的水環(huán)境因子的影響微生物群落結(jié)構(gòu)并非一成不變，即其對水質(zhì)變化有一定程度的動態(tài)響應(yīng)。在實際生產(chǎn)中可以合理調(diào)節(jié)生物濾池內(nèi)COD濃度來穩(wěn)定生物濾池運行期的微生物群落結(jié)構(gòu)，增加硝化螺旋菌屬、亞硝化單胞菌屬細菌的豐度，從而提高生物濾池的水處理效率。