調節性T細胞在陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥異?？寺≈械拿庖邫C制研究

林鶯 張榮東 陳琦 陳仁利

寧德師范學院附屬寧德市醫院血液科，寧德 352100

陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種獲得性造血干細胞基因突變的克隆性疾病，現認為其發病主要為PIG-A基因突變［1］，但單純的PIG-A基因突變并不能解釋其異?？寺楹文軘U增并占據優勢。文獻報道，免疫因素和PNH 的發病及治療效果有關，PNH 存在T 細胞免疫功能的亢進，該異常使造血干細胞易受到免疫系統攻擊，而PNH 克隆能逃避該免疫攻擊而獲得生存優勢［2-4］。調節性T 細胞是CD4+T 細胞，在體內能抑制免疫反應，有關調節性T 細胞在PNH 發病中的作用尚不清楚，且文獻報道鮮見，故為探討調節性T細胞在PNH 異?？寺≈锌赡艿拿庖邫C制，本研究測定了PNH 患者T 細胞抑制性調節的變化，以此探討PNH 患者體內異?？寺∈欠裼姓{節性T細胞的參與以及PNH 克隆擴增優勢的可能免疫因素。

資料與方法

1、一般資料

2018 年1 月至2022 年1 月在寧德師范學院附屬寧德市醫院住院或門診就診的31例PNH 患者為病例組，其中發作性PNH 患者15 例、再生障礙性貧血-陣發性睡眠性血紅蛋白尿（aplastic anemia-paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，AA-PNH）患者 16 例。31 例患者中男 21 例、女 10 例，年齡20～69 歲、中位年齡 37 歲；其中發作性 PNH 組男 10 例、女5 例，年齡 23～69 歲、中位年齡 35 歲，PNH 克隆值 20%～66%、中位PNH 克隆值48%，血常規示白細胞計數1.33～6.56 ×109/L、中位白細胞計數 2.68 ×109/L，血紅蛋白56～99 g/L、中位血紅蛋白73 g/L，血小板計數12～48×109/L、中位血小板計數 21 ×109/L；AA-PNH 組男 11 例、女 5 例，年齡20～68 歲、中位年齡39 歲，PNH 克隆值19%～59%、中位PNH 克隆值42%，血常規示白細胞計數1.01～5.76 ×109/L、白細胞計數2.75×109/L，血紅蛋白57～105 g/L、中位血紅蛋白72 g/L，血小板計數13～51 ×109/L、中位血小板計數23 ×109/L。兩組在性別、年齡、PNH 克隆大小及血象情況基線匹配，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。25 例正常健康體檢者為對照組，其中男14 例、女11 例，年齡19～56 歲、中位年齡38 歲，病例組與對照組在性別、年齡等一般資料方面比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。納入標準：既往確診或新診斷的PNH 患者，包括AA-PNH 患者，PNH 克隆陽性，同時無自身免疫性疾病病史、近期無感染史，診斷符合國內統一標準［5］。排除標準：PNH 克隆陰性或者同時存在自身免疫性疾病或近期有嚴重感染者。

本研究通過寧德師范學院附屬寧德市醫院倫理委員會批準（審查編號：20191009），同時受試者均知情同意并簽署知情同意書。

2、主要試劑和儀器

鼠 抗 人 CD4-FITC （No. 345621） 、 CD25-PE（No. 558605）、轉 化 生 長 因 子 - β（TGF- β）1-R PE（IQP-117R）等及各單抗同型對照均為美國Becton Dickinson 公司產品；淋巴細胞分離液（LTS1092PK）、Trizol RNA Reagent（No.28111-03A）、人TGF-β1（No.D622）和白細胞介素-10（IL-10）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）（No.D710）試劑盒等均購于美國Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式細胞儀為美國Becton Dickinson 公司產品；PCR 儀器為日本Takara公司產品。

3、實驗步驟

3.1、流式細胞儀檢測T細胞及Th細胞的亞群、調節性T細胞數量 采用細胞表面分子標記方法，CD4+CD25+調節性T 細胞數量測定采用單克隆抗體雙標法，CD3+CD4+TGF-β+（Th3）細胞數量測定采用單克隆抗體三標法，細胞的絕對數應用二步法，將測得的細胞百分比乘以外周血單個核細胞絕對數即為該細胞的總數量。

3.2、叉頭框蛋白P3（FOXP3）及TGF-β 的mRNA 表達檢測 靜脈血分離得到單個核細胞，提取總RNA，進行RNA純度測定，紫外分光光度計測OD260/280的比值，吸光度OD260/280＞1.8，然后進行 RNA 逆轉錄，獲得 cDNA，行 PCR 擴增檢測，引物由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成，按比例配置反應體系，計算機分析獲得樣本及內參的Ct 值后行數據處理。

3.3、TGF-β 及IL-10濃度檢測 收集各組樣本血漿，按照TGF-β1 及IL-10 ELISA 試劑盒說明書進行操作，算出濃度。

4、統計學分析

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較用F檢驗，兩兩比較采用Bonferroni 方法校正；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較用H檢驗；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1、各組T細胞及Th細胞的亞群變化

AA-PNH 組CD4+/CD3+細胞和CD4+/CD8+比例低于對照組，CD8+/CD3+細胞高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而發作性 PNH 組與對照組的 CD4+/CD3+細胞、CD4+/CD8+比例及CD8+/CD3+細胞的比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。 AA-PNH 組 與 發 作 性 PNH 組 的 Th1/CD3+CD4+細胞均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；各組的Th2/CD3+CD4+細胞比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 PNH患者各亞組與對照組T細胞及Th細胞的亞群變化比較

2、各組調節性T細胞和Th3細胞變化

AA-PNH 組 及 發 作 性 PNH 組 CD4+CD25+T 細 胞 和Th3細胞的數量均高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 PNH患者各亞組與對照組外周血中CD4+CD25+T細胞和Th3細胞的數量和比例（）

表2 PNH患者各亞組與對照組外周血中CD4+CD25+T細胞和Th3細胞的數量和比例（）

注：對照組為健康體檢者，PNH為陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥，AA-PNH 為再生障礙性貧血-陣發性睡眠性血紅蛋白尿；a指占CD4+T淋巴細胞的比例，b指占外周血淋巴細胞的比例；與對照組相比，cP＜0.05；與AA-PNH組相比，dP＜0.05

比例（%）b 9.89±1.23cd 4.85±1.02c 2.18±0.53 4.762 0.030組別發作性PNH組AA-PNH組對照組F值P值例數15 16 25 CD4+CD25+T細胞數量（×106/L）97.11±17.10cd 67.82±15.67c 43.86±9.52 7.016 0.003比例（%）a 28.03±3.21cd 13.35±2.72c 8.52±1.57 5.107 0.021 Th3細胞數量（×106/L）82.27±15.15cd 57.15±10.58c 42.35±9.33 6.354 0.005

3、各組FOXP3及TGF-β的mRNA表達

發作性 PNH 組和 AA-PNH 組的 FOXP3 及 TGF-β 的mRNA 陽性表達率均高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表3。

表3 PNH患者各亞組與對照組FOXP3及TGF-β的mRNA陽性表達情況[例（%）]

4、各組TGF-β及IL-10濃度

AA-PNH 組、發作性 PNH 組 TGF-β 及 IL-10 濃度均高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 PNH 患者各亞組與對照組 TGF-β 及 IL-10 的濃度情況（）

注：對照組為健康體檢者，PNH 為陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥，AA-PNH 為再生障礙性貧血-陣發性睡眠性血紅蛋白尿；TGF-β 為轉化生長因子-β，IL-10 為白細胞介素-10；與對照組相比，aP＜0.05；與AA-PNH組相比，bP＜0.05

IL-10（pg/ml）7.86±1.17ab 5.57±1.13a 1.33±0.49 5.865 0.008組別發作性PNH組AA-PNH組對照組F值P值例數15 16 25 TGF-β（μg/L）49.76±2.03ab 37.29±1.78a 17.01±3.27 5.365 0.012

討 論

PNH 主要特征為造血細胞表面缺乏糖基磷脂酰肌醇連接蛋白而引發補體介導的血管內溶血［6］。至今關于PNH 克隆如何獲得增殖優勢沒有很好的解釋。文獻報道，骨髓中可能存在選擇壓力有助于發生基因突變的造血干細胞增殖，PNH 和再生障礙性貧血的相關性表明這種選擇壓力是免疫介導的［7-8］。研究發現，免疫因素和PNH 的發病及治療反應有關［9］。PNH 患者行同基因骨髓移植時，使用免疫抑制藥物的預處理可提高長期緩解率［10］。本研究在探討PNH患者體內T細胞亞群變化時，發現PNH 患者CD4+/CD3+細胞和CD4+/CD8+比例低于對照組，而CD8+/CD3+細胞高于對照組，CD4+/CD8+比例倒置；同時AA-PNH 組與發作性PNH 組的Th1/CD3+CD4+細胞均高于對照組，這與既往國內外相關報道是一致的，也進一步證實了PNH 存在T 細胞免疫功能的異常，其可能造成骨髓造血功能衰竭。

對于是否存在T細胞免疫的負調控在PNH 的增強引起PNH 克隆的擴增，目前報道鮮見。體外實驗結果表明，CD4+CD25+T 細胞的抑制效應可能通過膜結合分子間的接觸而起作用，還可能通過抑制性因子如IL-10 和TGF-β 等發揮作用［11］。Th3細胞是誘導產生TGF-β并表達FOXP3細胞，能誘導調節T 細胞，抑制Th1 細胞增殖及細胞因子釋放［12］。研究表明，FOXP3 是調節性T 細胞較為特異性標志，調節性T 細胞的抑制功能也同FOXP3 的表達有密切關系［13-14］。Wolf 等［15］研究表明，FOXP3 表達量影響卵巢癌患者的總生存及無進展生存，其高表達可逃避免疫監視。本研究檢測到AA-PNH 組及發作性PNH 組CD4+CD25+調節性T細胞和CD3+CD4+TGF-β+（Th3）細胞的數量以及FOXP3表達的陽性率均高于對照組，其中以發作性PNH 組改變最為明顯。表明調節性T 細胞的增多影響了PNH 克隆，繼而影響PNH 造血微環境，使抑制性細胞因子如TGF-β 和IL-10 等水平升高，在受到異常抗原刺激時，擴增的調節性T細胞抑制效應T細胞，使PNH克隆可能逃避免疫監視而不被有效清除。

目前一般認為，PNH 克隆組成與白血病及其他腫瘤有相似的生物學特征，Hirai 等［16］認為，若阻斷或抑制調節性T細胞功能可能治療異?？寺⌒约膊　GF-β 可以誘導FOXP3 的表達從而維持調節性T 細胞的抑制活性［17-18］。研究表明，TGF-β 的量和是否出現促炎癥細胞因子決定了FOXP3 表達，同時決定了CD4+T 細胞是否成為調節性T 細胞的命運［19-20］。本研究結果顯示，AA-PNH 組、發作性PNH組的 FOXP3 及 TGF-β 的 mRNA 表達陽性率和 TGF-β 及IL-10 的濃度均高于對照組，這表明PNH 患者體內FOXP3、TGF-β 及 IL-10 均呈高表達，即 CD4+T 細胞的免疫負調控在PNH 患者中增強，這有可能使PNH 克隆得以逃避免疫監視。提示在PNH 的發病過程中，免疫系統的異常使PNH 克隆增殖。

總之，本研究結果提示，PNH 患者調節性T 細胞數量增多，功能亢進，同時分泌 FOXP3、TGF-β 及 IL-10 細胞因子增多，提示調節性T 細胞的免疫抑制作用增強，可能在PNH異?？寺≈衅鹆颂颖苊庖弑O視的作用，但還需要加大病例數進一步驗證結果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突