磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B信號通路參與龍葵堿抑制PC-3細胞增殖與凋亡過程的機制研究※

喬澤昀,王 鵬,趙文兵

(1.山西中醫藥大學,山西 晉中 030619;2.山西省中西醫結合醫院,山西 太原 030013)

前列腺癌是男性生殖系統的惡性腫瘤之一,發病率較高。雄激素剝奪療法在前列腺癌的晚期治療中起著重要作用,然而多數患者在治療14～30個月后都會進展為去勢抵抗性前列腺癌,患者生存期較短[1-2]。龍葵堿是一種由茄科植物龍葵提取分離出的生物堿,具有抑制腫瘤細胞生長,促進腫瘤細胞凋亡的作用,其機制可能與靶向作用于腫瘤細胞內、外源性凋亡途徑的多個靶點有關[3]。磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路在腫瘤細胞的存活和抗凋亡中發揮重要作用,其中活化的Akt[磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)]可以磷酸化多種與細胞存活相關的下游底物,從而抗細胞凋亡[4-5]。本研究主要觀察PI3K/AKt信號通路在龍葵堿體外誘導人前列腺癌PC-3細胞增殖與凋亡機制中的作用,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人前列腺癌PC-3細胞株取自山西中醫藥大學中西醫結合醫院中心實驗室;CCK8試劑盒購自東仁化學科技有限公司;小牛血清、DMEM培養基購自美國Hyclone公司;龍葵堿(純度≥99%)購自曼斯特(成都)生物科技有限公司;用于檢測細胞凋亡的試劑盒來源于宇恒(蘇州)生物科技有限公司;PI3K、p-Akt、Bax、Akt、Bcl-2、Caspase-3、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶(p-PI3K)等抗體均購自美國Cell Signaling公司。

1.2 細胞培養 取前列腺癌PC-3細胞株,培養基選擇DMEM培養基(含10%小牛血清),在37℃、5%CO2混合氣體環境的孵箱中進行培養,培養前需加入100 U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素以保證環境穩定。2～3 d為實驗細胞換液,實驗細胞約3～5 d可進行傳代。

1.3 應用CCK-8法檢測龍葵堿對PC-3細胞增殖抑制率 從培養好的PC-3細胞株中選取對數生長期的實驗細胞,保證細胞存活率等條件相同,同樣選取DMEM培養基(含10%的小牛血清),保證培養基完好,再添加0.25%胰蛋白酶促成消化反應,經過上述步驟后,把實驗細胞制成單細胞懸液,細胞密度為5×104個/m L,再把單細胞懸液接種在96孔板上,每孔約100μL,接種完畢后,在37℃、5%CO2混合氣體環境的培養箱中預培養24 h,培養完畢后,將20μL不同濃度(0.5、2、8μg/m L)的龍葵堿分別注入孔板的每個孔中。在對照組(不加入任何藥物)中,需要在每組中再多設置6個復孔,每個復孔呈平行狀態,培養24、48、72 h后,再測定細胞增殖抑制率。實驗完畢后,需要在每個孔中再加入10μL的CCK-8溶液,置于37℃、5%CO2混合氣體環境條件下持續培養,時間約為2 h。最后用全自動酶標儀檢測450 nm處的吸光值(OD值),細胞增殖抑制率(%)＝(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.4 應用流式細胞儀檢測龍葵堿對PC-3細胞凋亡的影響 制備細胞,選取培養好的對數期實驗細胞,保證細胞培養成功率的前提下進行細胞接種,密度定為2.0×105個/m L,實驗分組方法同前。將分好組的實驗細胞培養24 h,培養完畢后,取出并放入15 m L離心管內,加入胰酶將其制為成單細胞懸液,注意貼壁細胞需要用PBS緩沖液進行洗滌,最后依照儀器說明書檢測細胞的凋亡情況。

1.5 應用蛋白質印跡法(Western Blot)檢測PI3K/Akt通路中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及凋亡過程中Bax、Bcl-2、Caspase-3等相關蛋白的表達 將實驗細胞PC-3取出,在保證培養成功率的前提下,接種于4個培養瓶中,每組1瓶,4組分別記錄為對照組(生理鹽 水)、低劑量組 (0.5μg/m L)、中劑量組(2μg/m L)、高劑量組(8μg/m L)。細胞貼壁后棄上清液,分別添加藥物后在同一條件下培養24 h。收集全部細胞,在4℃條件下用PBS緩沖液洗滌兩次,添加預冷好的細胞裂解緩沖液,進行冰上裂解。15 min后將裂解產物在4℃條件下10 000×g離心30 min取上清液。確保步驟完善及樣本無誤后,用Bradford法測蛋白濃度。將等量的樣品在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下進行蛋白質分離,電泳完畢后,在37℃條件下,將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上,再用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h,分別與Bcl-2、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K等抗體,在37 ℃條件下持續反應2 h,再用辣根酶標記的第二抗體在37℃條件下持續反應1 h,用磷酸緩沖鹽溶液(PBST)充分洗滌兩次,每次15 min,使用DAB進行顯色并進行記錄和掃描,之后用抗actin抗體進行檢測,確認上樣量最終是否一致。

1.6 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件處理數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示,多組比較采用方差分析,組間比較采用t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 龍葵堿對PC-3細胞的增殖抑制作用 MTT結果顯示,龍葵堿可抑制PC-3細胞的增殖,PC-3細胞增殖抑制率隨龍葵堿濃度提高和作用時間延長而升高,與對照組比較,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 龍葵堿對PC-3細胞的增殖抑制作用

2.2 龍葵堿對PC-3細胞凋亡的影響 結果顯示,龍葵堿呈濃度依賴性地進行誘導PC-3細胞凋亡,PC-3細胞凋亡百分率隨龍葵堿濃度提高而升高。見表2、圖1。圖1。

圖1 不同濃度龍葵堿處理24 h對PC-3細胞凋亡的影響

2.3 龍葵堿作用PC-3細胞 PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt及凋亡過程中 Bax、Bcl-2、Caspase-3、P53表達變化 Western blot結果顯示,龍葵堿可呈濃度依賴性地下調p-PI3K、Bcl-2、p-Akt蛋白表達,上調Bax、Caspase-3、P53蛋白表達。對Akt、PI3K無明顯影響。見表3、4及圖2。

表3 不同濃度龍葵堿處理PC-3細胞24 h后磷酸化蛋白激酶B、蛋白激酶B、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶、磷脂酰肌醇-3-羥激酶蛋白的表達(±s)

表3 不同濃度龍葵堿處理PC-3細胞24 h后磷酸化蛋白激酶B、蛋白激酶B、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶、磷脂酰肌醇-3-羥激酶蛋白的表達(±s)

注:p-Akt,磷酸化蛋白激酶B;Akt,蛋白激酶B;PI3K,磷脂酰肌醇-3-羥激酶;p-PI3K,磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶。

組別 p-Akt Akt p-PI3K PI3K高濃度組 0.24±0.02 0.52±0.02 0.21±0.12 0.55±0.03中濃度組 0.28±0.01 0.54±0.01 0.25±0.01 0.57±0.02低濃度組 0.31±0.01 0.54±0.01 0.28±0.02 0.59±0.01對照組 0.37±0.01 0.54±0.01 0.36±0.03 0.60±0.01 F值 34.68 1.15 30.48 2.51 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05

表4 不同濃度龍葵堿處理PC-3細胞24 h后Bax、Bcl-2、Caspase-3、P53蛋白的表達(±s)

表4 不同濃度龍葵堿處理PC-3細胞24 h后Bax、Bcl-2、Caspase-3、P53蛋白的表達(±s)

組別 Bax Bcl-2 Caspase-3 P53高濃度組 0.46±0.01 0.22±0.03 0.43±0.07 0.39±0.14中濃度組 0.44±0.01 0.30±0.02 0.39±0.04 0.34±0.01低濃度組 0.36±0.03 0.35±0.03 0.35±0.03 0.31±0.01對照組 0.28±0.03 0.40±0.01 0.25±0.01 0.22±0.02 F值 28.28 8.61 7.91 27.64 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 不同濃度龍葵堿作用于PC-3細胞24 h后PI3K/Akt通路中磷酸化蛋白激酶B、蛋白激酶B、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶、磷脂酰肌醇-3-羥激酶蛋白及凋亡過程中Bax、Bcl-2、P53-Caspase-3等蛋白的表達

3 討論

龍葵堿是從龍葵中提取出的一種生物堿。現代藥理學研究表明,龍葵堿是龍葵發揮藥理作用的主要成分,包括茄堿、茄解堿、澳洲茄堿及澳洲茄邊堿等[3]。近年研究發現,龍葵堿可誘發細胞凋亡、阻滯細胞周期、誘導細胞自噬、抑制上皮-間質轉化、抑制腫瘤血管生成等方面抑制前列腺癌、宮頸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、腦膠質瘤等多種腫瘤的生長[6-9]。

本研究主要觀察PI3K/AKt信號通路在龍葵堿體外誘導人前列腺癌PC-3細胞增殖與凋亡機制中的作用,結果顯示龍葵堿可抑制PC-3細胞增殖,PC-3細胞增殖抑制率隨龍葵堿濃度提高和作用時間延長而升高(P＜0.05),即呈濃度依賴性,此結論初步證實龍葵堿在體外環境下的抗腫瘤作用。細胞凋亡作為腫瘤細胞主動性程序性死亡的過程,是抗腫瘤或抑制腫瘤細胞周期生長的重要機制[10]。Bcl-家族在調控細胞凋亡通路的基因中起到重要作用,包括抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax。P53與線粒體的凋亡密切相關,可促進Noxa、Puma及Bax等凋亡相關基因的表達,與抑凋亡蛋白Bcl-x L等相結合,從而釋放Bax,還可直接和Bax、Bak結合并使之激活[11-12]。本研究結果表明,龍葵堿可呈濃度依賴性地下調p-PI3K、Bcl-2、p-Akt蛋白表達(P＜0.05),上調Bax、Caspase-3、P53蛋白表達(P＜0.05);流式細胞儀檢測結果表明,龍葵堿呈濃度依賴性地進行誘導PC-3細胞凋亡,PC-3細胞凋亡百分率隨龍葵堿濃度提高而升高(P＜0.05),提示龍葵堿可能通過抑制Bcl-2蛋白表達,加強Bax蛋白表達,激發PT通道的開放,使線粒體通透性加強,導致在細胞外面的Ca2+大量進入細胞中,過量的Ca2+使線粒體的電位下降;另一方面使線粒體膜內相對高滲,基質膨脹,導致外膜破裂,從而釋放細胞色素C,細胞色素C進入胞質內,激活Caspase家族級聯反應,最終導致Caspase-3的活化而誘導凋亡發生[13-15]。

PI3K/Akt信號通路與腫瘤衰亡密切相關,同時該通路也參與許多重要的生物學過程。信號通路中的AKT可影響其下游的多種效應分子如Bcl-2等,從而發揮其抗凋亡作用,最終導致腫瘤細胞凋亡抑制。相關研究表明,PI3K/Akt信號通路與多種惡性腫瘤的發生密切相關[16-18]。目前,PI3K/Akt信號通路在龍葵堿誘導PC-3細胞凋亡的過程中的作用未見相關報道。在本研究中,龍葵堿呈濃度依賴性地降低PI3K、Akt磷酸化水平,說明龍葵堿可能通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導PC-3細胞凋亡。

綜上所述,龍葵堿可抑制PC-3細胞增殖,誘導PC-3細胞凋亡,其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路有關。本研究證實龍葵堿對PC-3細胞具有體外抑制作用,為龍葵堿的臨床應用提供了新的理論基礎,同時也為相關藥物的研制提供了實驗數據,然而龍葵堿對前列腺癌細胞是否存在體內抑制作用尚不明確。此外,在龍葵堿抑制PC-3細胞增殖與凋亡過程中PI3K/AKT信號通路是否與其他通路存在相互作用,仍待進一步研究證實。