G蛋白偶聯雌激素受體1的理化性質及其分子結構的分析

王 道, 陳建林

（中南大學湘雅二醫院婦產科, 長沙 410011）

雌激素（estrogen）屬于類固醇激素, 在細胞生理及病理過程中具有廣泛而重要的調節作用。G蛋白偶聯雌激素受體1（G protein-coupled estrogen receptor1, GPER1）, 又名GPR30, 是一種功能性雌激素受體, 主要參與調節雌激素活化的快速非基因信號通路[1-2]。2002年, Filardo等[3]報道了該受體對雌激素有高度的親和力, 定位于質膜或內質網中, 其在不同類型的組織中表達, 包括腦、肺、肝、脂肪組織、血管及免疫細胞等。然而, GPER1的發現使得研究雌激素受體蛋白在許多疾病中的作用變得更加復雜, 因為GPER1的表達可能取決于物種、組織、年齡和性別[4]。既往研究表明, 敲除GPER1可以抑制PI3K/AKT信號通路介導上皮細胞間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）, 從而阻礙胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[5]。另有研究證實, GPER1還能觸發不同的級聯反應, 特別是在乳腺癌細胞和腫瘤微環境中介導刺激作用[6], GPER1能夠分別觸發腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）和乳腺腫瘤細胞中的重組人白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）以及白介素受體1（interleukin-1 receptor 1, IL1R1）的表達[7]。大量研究數據也都表明, GPER1在大多數惡性腫瘤疾病中表達, 如黑色素瘤[8]、胰腺癌[9]、前列腺癌[10]、結直腸癌[11]和肝細胞癌[12]等, 因此, GPER1可能成為治療癌癥的靶點。此外, GPER1在小鼠模型中被證實可調節體重和葡萄糖/脂質的穩態, 發揮抗肥胖和抗糖尿病作用, 使其還可能成為治療肥胖和糖尿病的有效藥物[13]。最新研究報道, GPER1與多發性硬化癥、帕金森氏病、動脈粥樣硬化相關炎癥有關[14], 但確切的分子調節機制尚不明確。

本研究借助多種生物信息學在線工具對GPER1蛋白的理化性質、分子結構、腫瘤相關性等方面進行綜合分析, 以期闡明GPER1結構特性及其在腫瘤中的內在機制, 為探究其介導的信號傳導機制提供理論依據, 為癌癥等疾病的治療提供候選靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

通過美國國立生物技術信息中心數據庫（national center for biotechnology information, NCBI）[15], 搜尋基因數據庫并且下載得到人類GPER1的氨基酸序列信息, GenBank登錄號為NP_001091671。

1.2 方法

獲得人類GPER1蛋白的FASTA格式的氨基酸序列, 通過多種軟件和網站預測和分析GPER1理化性質、信號肽結構、跨膜結構、亞細胞定位、二級結構、翻譯后修飾位點、相互作用的蛋白網絡以及與腫瘤的相關分析（表1）。

表 1 預測分析人GPER1的生物信息數據庫及網站Tab. 1 Bioinformatic databases and websites for predictive analysis of human GPER1

2 結果與分析

2.1 GPER1的理化性質分析

進入ExPasy網站[16], 利用Protparam在線對人類GPER1的理化性質分析, 結果表明：該蛋白的相對分子質量為42 247.59 Da；理論等電點為8.63, 分子式為C1938H3018N510O509S20, 分別含有30個帶正電荷的氨基酸殘基（Arg + Lys）和25個帶負電荷的氨基酸殘基（Asp + Glu）；總原子數為5 995；消光系數為39 015, 半衰期為30 h, 不穩定系數為48.12, 屬于不穩定蛋白, 脂肪系數為110.51, 親水性平均值為0.449, 表明該蛋白是疏水性蛋白。組成GPER1的氨基酸共有20種, 其中含量最高的是異亮氨酸, 占13.60%；含量最少的是色氨酸, 只有1.07%（表2）。

表2 GPER1的氨基酸組成Tab. 2 Amino acid composition of GPER1

ProtScale在線分析GPER1的親疏水性, 結果表明：最強的親水位點在第250位的亮氨酸, 親水值為 2.656；最強的疏水氨基酸是265位的纈氨酸, 親水性分值為3.567。ProtScale分析的367個氨基酸（第5～371位）中有39.23%分布在低分值區域, 總得分為 121.137；60.49%分布在score大于0區域, 總得分為285.134。這表明親水氨基酸少于疏水氨基酸, GPER1存在大量疏水域, 人類GPER1屬于疏水性蛋白（圖1）。

2.2 GPER1信號肽結構和跨膜結構分析

登錄SignalP 5.0 Server網站[17], 分析人類GPER1信號肽序列, 結果顯示, 存在信號肽的概率為0.003%, 而且沒有發現切割位點, 推測不存在信號肽序列（圖2）。

進入TMHMM 2.0網站[18], 分析人GPER1跨膜結構, 結果發現了7個跨膜結構區域, 分別位于第63～85位、第97～119位、第134～153位、第174～196位、第219～241位、第262～284位、第304～326位氨基酸殘基之間（圖3）。

2.3 GPER1亞細胞定位分析

PSORTII在線網站[18]對人類GPER1進行亞細胞定位分析, 結果顯示, 人類GPER1定位于不同細胞器的可能性分別是：細胞質膜（60.90%）、內質網（13.00%）、液泡（17.40%）、線粒體（4.30%）和高爾基體（4.30%）（表 3）。

表3 人GPER1蛋白的亞細胞定位可能性Tab. 3 Subcellular localization probability of human GPER1 unit: %

2.4 GPER1的二級結構和結構域分析

PSIPRED在線網站[19]預測人類GPER1蛋白質的二級結構, 結果顯示, 多肽鏈中α-螺旋占68.53%, 無規則卷曲占29.87%, β-折疊鏈占1.60%（圖4）。保守結構域分析結果顯示, GPER1屬于7TM_GPCRs 超家族, 該結構域由276個氨基酸殘基組成（圖5）。

2.5 GPER1翻譯后修飾位點分析

進入ExPasy網站[16], 利用NetNglyc-1.0、NetOGlyc-4.0、NetPhos3.1在線分別對人GPER1N-糖基化位點、O-糖基化位點和磷酸化位點進行分析。結果表明：人類GPER1存在4個潛在的N-糖基化位點, 分別位于第25、32、44和84位的氨基酸（圖6）；10個潛在的O-糖基化位點, 分別位于第4、5、18、26、27、28、34、40、46和287位的氨基酸；27個潛在的磷酸化位點, 其中絲氨酸磷酸化位點17個, 蘇氨酸磷酸化位點7個, 酪氨酸磷酸化位點3個（圖7）。

2.6 GPER1蛋白互作的網絡分析

進入STRING12.0數據庫網站[20], 預測與GPER1發生相互作用的蛋白, 構建了與GPER1蛋白相互作用的網絡圖（圖8）。與GPER1發生相互作用的蛋白質評分前10名的有雌激素受體1（estrogen receptor 1, ESR1）、Discs大同源物4（discs large homolog 4, DLG4）、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白Q（guanosine nucleotide-binding protein Q, GNAQ）、G蛋白α亞基（G protein alpha-subunit, GNAS）、雌激素受體2（estrogen receptor 2, ESR2）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase, SRC）、G蛋白偶聯受體62（G protein-coupled receptor 62, GPR62）、G蛋白偶聯受體61（G protein-coupled receptor 61, GPR61）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、酪氨酸蛋白激酶2（protein tyrosine kinase 2, PTK2）, 相關評分分別是0.985、0.957、0.935、0.925、0.921、0.915、0.909、0.908、0.839、0.814。

2.7 GPER1與腫瘤的相關性分析

GPEIA數據庫[21]顯示出人GPER1在不同類型腫瘤組織中的表達水平, 結果表明, 人GPER1在腎上腺皮質癌（adrenocortical carcinoma, ACC）、膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma, BLCA）、乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma, BRCA）、宮頸鱗癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma, CESC）、結腸癌（colon adenocarcinoma, COAD）、腎嫌色細胞癌（kidney chromophobe renal cell carcinoma, KICH）、肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）、 直腸腺癌（rectum adenocarcinoma, READ）、胃癌（stomach adenocarcinoma, STAD）、子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma, UCEC）組織中低表達（P＜0.05）（圖 9）。

圖 8 與人GPER1相互作用的蛋白網絡Fig. 8 Protein network interacted with human GPER1

采用人類蛋白質圖譜（the human protein atlas, HPA）數據庫中GPER1在UCEC腫瘤組織和正常子宮內膜組織中的免疫組化的結果進行驗證。結果顯示, GPER1在子宮內膜腫瘤細胞中染色強度為弱, 數量小于25%（圖10a）, 在正常組織中染色強度中等, 數量為75%（圖10b）。由此可知, GPER1在UCEC中的表達量低于其在正常子宮內膜組織中的表達, 而且在UCEC中的陽性表達全部集中在細胞質和膜質上。

分析人GPER1的表達水平與UCEC患者的生存期的關系, 從“TCGA”來源的GPEIA數據庫獲取GPER1高表達患者和低表達患者的總體生存期（overall survival, OS）曲線和無病生存期（disease free survival, DFS）曲線。結果表明：在UCEC中GPER1低表達患者的總生存率分析中, 其LogrankP=0.170, 差異不顯著；在UCEC中GPER1低表達患者的無病生存期低于其高表達患者, 其LogrankP=0.042, 差異顯著（圖 11）。

利用cBioPortal數據庫分析GPER1突變信息和其對UCEC預后的影響, 結果表明, TCGA數據庫1 450例子宮內膜癌患者樣本中, 其中17例發生GPER1擴增, 4例深度刪除, 2例截短突變, 14例錯義突變, 共37例患者的GPER1發生突變, 基因突變率為2.6%（圖12a）。同時,GPER1基因突變對UCEC患者的OS有明顯的影響, 能顯著降低患者總生存率, 差異有統計學意義（P＜0.05）, 但對UCEC患者的DFS沒有顯著影響（P＞0.05）（圖12b）。

3 討論

GPER1基因位于人類染色體7p22.3上, 與其他GPCRs相似, GPER1的N端區位于細胞外, 而C末端區在細胞內[22]。本研究結果顯示, GPER1屬于不穩定的疏水性蛋白質, 由20種氨基酸組成, 無信號肽, 含有7次跨膜結構域, 亞細胞主要位于細胞質膜上, 提示該蛋白主要在細胞質膜上發揮重要功能, 有利于胞外信號分子傳遞到胞內產生信號反應, 這個結果與跨膜結構預測分析是一致的, 正電荷氨基酸殘基數目多于負電荷氨基酸殘基, 表明該蛋白傾向結合某些帶負電荷基團。GPER1的二級結構以α-螺旋為主, 無規則卷曲散布在結構內, 使其空間結構復雜多樣, 這與Khan等[23]研究報道相一致。GPER1的結構多樣性并具有多種生理功能, 結構域分析它屬于GPCRs超家族, 7TM保守結構域位于60～335位氨基酸。GPCRs是人體內最大的膜受體蛋白家族, 在生殖、神經、心血管、免疫和內分泌等系統發揮著重要的調控作用[24], 使其可能成為治療藥物的主要靶點。

磷酸化和糖基化位點預測表明, 除結構域以外的其他氨基酸可能對GPER1起修飾激活的作用。哺乳動物正常細胞的生長和存活, 以及腫瘤細胞的遺傳、代謝、炎性和微環境機制改變都與糖基化修飾改變密切相關[25]。有文獻報道, GPER1 N-端的結構域中的Asn44是受體結構和活性所必需, 但是Asn25和Asn32不會發揮任何主要作用[26]。本文糖基化修飾結果表明：GPER1存在4個N-糖基化位點, 分別位于第25、32、44和84位的氨基酸；10個O-糖基化位點, 分別位于第4、5、18、26、27、28、34、40、46和287位的氨基酸。Pupo等[27]研究表明, 缺失糖化的GPER可能會誘發乳腺癌細胞遷移, 因此, 特異性干擾GPER糖蛋白可作為一種新的治療策略。異常磷酸化途徑也會與許多疾病發展有關[28]。本文結果顯示, GPER1存在27個磷酸化位點, 其中絲氨酸磷酸化位點17個, 蘇氨酸磷酸化位點7個, 酪氨酸磷酸化位點3個, 這些磷酸化位點的功能尚未知曉, 有待進一步研究。

通過STRING可知, 與GPER1發生相互作用的TOP10蛋白, 包括ESR1、DLG4、GNAQ、GNAS、ESR2、SRC、GPR62、GPR61、EGFR、PTK2。有文獻報道, 在體外過表達ESR1能夠抑制JAK/STAT3信號通路, 阻礙細胞增殖、遷移[29]；前列腺癌中DLG4的表達水平與正常組織存在顯著差異[30]；GNAQ被抑制可誘導EMT過程, 促進腫瘤侵襲性[31]；GNAS可以促進小鼠炎癥性肝細胞癌的發展, 并與較差的存活率相關[32]；ESR2和SRC表達模式與卵巢腫瘤發生相關聯[33]；GPR62和GPR61能激活雄性生殖細胞cAMP途徑[34]；EGFR發生二聚化和磷酸化, 其激活機制與肺腺癌、膠質母細胞瘤和結直腸癌的發生密切相關[35]；在乳腺癌細胞的侵襲性研究中, FAK（又名PTK2）有助于GPER1介導STAT3激活, 促進三陰性乳腺癌細胞增殖[36]。GPER1與以上腫瘤相關的蛋白相互作用, 能夠影響不同類型腫瘤細胞, 提示該蛋白與腫瘤發生有密切聯系。

隨后, 本研究進一步查詢GPEIA數據庫發現：人類GPER1在ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD、KICH、LUAD、LUSC、READ、STAD、UCEC組織中的表達水平均低于癌旁正常組織, 可見GPER1的表達在上述腫瘤組織中被抑制。Zhang等[37]研究發現, 低水平的GPER1與淋巴結轉移密切相關。本研究還發現, 相比低表達的UCEC患者, GPER1高表達的患者無病生存率升高, 由此推測, 人類GPER1可作為UCEC病情評估的生物標志物。這與Deng等[38]認為GPER1在UCEC中起關鍵作用, 可作為預后觀察指標的觀點相一致。基因突變也與腫瘤形成和進展密切相關[39], 本研究中GPER1在UCEC患者中存在基因突變, 并且突變組UCEC患者總生存率明顯下降。

綜上所述, 本研究對人GPER1理化性質、分子結構和與腫瘤的關系進行探討, 提示該蛋白是癌癥臨床病理和預后相關的重要因子。但是, 由于數據庫的局限性可能會對數據產生一定的選擇偏倚, 人類GPER1自身還存在復雜的分子機制, 后續還需深入的臨床和試驗來驗證其在腫瘤疾病中的重要價值。