載脂蛋白E基因分型檢測室間質量評價計劃制定與實施

鮑 蕓， 權 靜， 張芃胤， 肖艷群

（上海市臨床檢驗中心臨床細胞分子遺傳學研究室，上海 200126）

載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）為一種多態性蛋白，是低密度脂蛋白受體的配體，在膽固醇和三酰甘油的轉運、儲存和代謝過程中發揮著重要作用。ApoE基因分型與人體的血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平密切相關，不同基因型與高血脂、心血管疾病和阿爾茨海默病的患病風險密切相關，對他汀類藥物的降脂效果也有一定的影響。人體內存在的3種ApoE蛋白異構體（E2、E3和E4）是由2個常見的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點rs429358和rs7412共同決定的，這2個位點的堿基變化產生了ε2、ε3、ε4等位基因型[1]，其對應的蛋白異構體分別為E2、E3和E4。ε2、ε3和ε4等位基因在中國人群中的分布頻率分別為9.5%、69.9%和15.5%[2]。

有研究結果表明，E2/E2基因型的高血脂患者服用普伐他汀降脂效果更好[3]。在中國人群中，E2基因型高血脂患者對阿托伐他汀和瑞舒伐他汀更敏感，用藥后血清總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平下降更明顯[4-6]。E3攜帶者是對他汀類藥物藥效最不敏感的個體[7]。個體化藥物基因組學數據庫PharmGKB（Pharmacogenomics Knowledge for Personalized Medicine）中將ApoE檢測定為2A級，屬于藥物使用前強烈建議檢測的位點[8]。由此可見，ApoE基因分型對指導個體化用藥有積極的作用。

目前，我國批準上市的ApoE基因檢測試劑盒有7種，檢測方法主要涉及熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和基因芯片，臨床實驗室已逐步開展該項目的檢測。檢測過程中涉及到血液基因組DNA純化、特異性PCR擴增、片段雜交、結果分析判定等，任一環節均會影響檢測結果的準確性。錯誤的基因分型結果會影響臨床正確選擇和使用他汀類藥物，降低療效，甚至危及患者生命。為評估臨床實驗室ApoE基因檢測能力，保證基因分型結果的準確性，本研究將基因組DNA作為質控品，開展ApoE基因分型檢測項目的室間質量評價（簡稱室間質評）計劃，以進一步提高臨床實驗室該項目的檢測質量。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2020年上海市臨床檢驗中心ApoE基因檢測室間質評計劃（2次）參評實驗室為36家，其中上海地區25家（公立醫療機構16家，第三方醫學檢驗實驗室9家），其他地區11家（公立醫療機構6家，第三方醫學檢驗實驗室5家）。

1.2 方法

1.2.1 室間質評物品盤準備 用血液基因組DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取人外周血基因組DNA。使用Sanger測序法（由武漢華因康基因科技有限公司完成）檢測ApoE基因rs429358和rs7412位點基因型，確定各基因組DNA相應位點的型別（野生型和不同的突變型），盡量涵蓋所有人群基因類型。制備5份能力驗證物品，其中2份分型結果一致，其余3份為不同分型物品。用NanDrop超微量紫外可見光分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）檢測基因組DNA的濃度和純度，用TE緩沖液溶解，濃度約為50 ng/μL，按照每支50 μL分裝成5支后，-20 ℃保存（不超過9個月）。5支物品隨機編碼后，通過冷鏈發送至各參評實驗室。要求參評實驗室在規定時間內按照常規物品檢測流程進行檢測，并將結果通過網絡上報至上海市臨床檢驗中心數據庫。

1.2.2ApoE基因分型檢測室間質評物品性能評價 （1）均一性評價。參照《CNAS-GL003：2018 能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》[9]要求，在第1次室間質評前，從制備好的能力驗證物品中選取1個批號，隨機抽取10個室間質評物品，采用ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）和ApoE基因分型試劑盒（武漢友芝友公司）檢測，每個物品重復檢測2次。（2）穩定性評價。在每次室間質評物品分發的同時，進行同步穩定性評價。選取3支同一批號的室間質評物品，采用ApoE基因分型試劑盒檢測，每支重復檢測2次。

1.2.3 室間質評結果評價與分析 依據回報結果計算各參評實驗室的得分情況。將2個SNP位點檢測基因型和根據基因型判定的分型結果與預期相符的百分率計為該實驗室本次室間質評成績。≥80分判定為室間質評成績合格。同時，計算總體符合率和不同檢測方法的符合率，并與實驗室溝通，分析錯誤檢測結果的原因。

2 結果

2.1 室間質評物品驗證結果

2020年室間質評物品2個SNP位點的基因型測序結果見圖1。2次室間質評物品盤構成及預期結果見表1。

圖1 室間質評物品Sanger測序檢測圖譜

表1 2020年室間質評物品盤構成和檢測符合率

采用熒光PCR分析室間質評物品的均一性和穩定性，結果顯示，均一性和穩定性檢測結果與預期基因分型結果一致，符合率為100%，室間質評物品均一性和同步穩定性滿足要求。

2.2 ApoE基因分型檢測總體回報情況

2020年ApoE基因檢測室間質評計劃參評實驗室為36家，2次室間質評收到的有效回報結果分別為32份和31份。2次室間質評活動中，參評實驗室主要采用熒光PCR法、基因雜交法和Sanger測序法檢測，分別占75%（24/32）和18.75%（6/32）、6.25%（2/32）和67.74%（21/31）、25.81%（8/31）和6.45%（2/31）。

2.3 參評實驗室檢測能力評價結果

2020年2次室間質評中，結果回報完全正確的實驗室分別占93.75%（30/32）和100.00%（31/31），總體檢測符合率分別為99.38%（318/320）和100.00%（310/310），基因分型判定總體符合率分別為97.5%（156/160）和100.00%（155/155）。錯誤回報結果主要發生在第1次室間質評中，有1家實驗室成績為80～99分，1家實驗室成績不合格（＜80分）。錯誤結果包含2個SNP檢測錯誤和4個基因分型結果判斷錯誤。第2次室間質評物品檢測總符合率為100.00%，且分型結果判斷全部正確。

2次室間質評各檢測方法的檢測效能比較結果顯示，基因雜交法和Sanger測序法檢測符合率均為100.00%，錯誤結果均發生在使用熒光PCR法的實驗室。2次室間質評活動中熒光PCR敏感性分別為98.18%和100.00%，特異性均為100.00%。見表2。

表2 不同檢測方法參評實驗室評價結果 家

3 討論

隨著精準醫療概念的提出和推廣，越來越多的個體化藥學基因檢測項目被應用于臨床，大大提高了特定藥物的療效，并減少了藥物不良反應的發生。本研究通過組織實施ApoE基因分型檢測室間質評計劃，對臨床實驗室相關項目檢測質量進行了比較全面的評估，結果顯示，2次室間質評中成績滿分的實驗室分別占93.75%和100.00%，提示參評實驗室總體檢測準確率較高。2次室間質評中，2個SNP檢測錯誤和4個基因分型結果判斷錯誤均出現在第1次室間質評中，分別來自2家實驗室，1家實驗室因2例SNP檢測錯誤直接導致2例基因分型結果判斷錯誤，該實驗室所用試劑不是商品化試劑，其使用的熒光PCR是實驗室自建方法（laboratory developed test，LDT）。與實驗室溝通后，分析其錯誤原因可能為其LDT所使用的檢測試劑性能不穩定，且未完成方法學確認。建議開展LDT檢測的實驗室從準確性、精確性、參考區間、可報告范圍、分析敏感性和特異性等方面完成方法學性能確認[9-10]，日常檢測中嚴格按照LDT的標準操作程序操作，并做好室內質控，以保證檢測質量；另1家實驗室為2個SNP檢測均正確，但基因分型結果判定錯誤。

2次室間質評不僅可考察了實驗室正確檢測物品中的變異的能力，還評價了實驗室根據2個SNP檢測結果判斷ApoE分型的遺傳學分析能力。ApoE基因分型結果判定是依據2個SNP位點（rs429358和rs7412）的檢測結果，SNP檢測結果與基因分型對應關系明確，對生物信息學分析能力的要求相對較低，推測實驗室錯誤結果主要原因是檢測人員對該項目相關人類遺傳學理論知識有所欠缺，提示部分實驗室檢測人員遺傳學分析能力不足，這也是實驗室比較薄弱的環節之一。

需要指出的是，在第1次室間質評中出現錯誤的2家實驗室在后續室間質評中物品檢測和結果分析全部正確，成績均為滿分。提示實驗室通過參加室間質評計劃能夠發現日常檢測中的問題，通過有針對性的分析和內部整改，達到改進質量、提高檢測水平的目的。

上海市臨床檢驗中心在我國首次開展了ApoE基因分型檢測室間質量評價計劃，該計劃可客觀評價臨床實驗室ApoE基因檢測質量，為幫助臨床實驗室改進和提高基因分型檢測能力，指導臨床精準用藥提供了有力的保障。