LDLR基因突變致純合子家族性高膽固醇血癥外周血單核細胞LDLR表達的研究

張 晰， 段明玥， 于 壯， 魏孟姣， 張艷敏

（1.西安交通大學附屬兒童醫院 西安市兒童醫院，陜西 西安 710003；2.西北婦女兒童醫院，陜西 西安 610113）

家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolemia，FH）是一種常染色體單基因顯性遺傳代謝性疾病，編碼低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）的LDLR基因是最常見的致病基因，LDLR基因突變可致細胞膜表面的LDLR缺失或功能異常，影響機體低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，LDL）的代謝，導致膽固醇代謝障礙，最終使血清低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平升高[1-2]。根據基因型，FH可分為雜合型家族性高膽固醇血癥（heterozygous familial hypercholesterolemia，HeFH）和純合型家族性高膽固醇血癥（homozygous familial hypercholesterolemia，HoFH）。HeFH攜帶1個致病等位基因，HoFH攜帶2個致病等位基因。HoFH較為罕見，患病率為1/100萬～3/100萬，HeFH患病率為0.20%～0.48%[1]。我國人群FH患病率為0.18%[2]。HoFH患兒的LDL-C水平是正常兒童的6～10倍，皮膚肌腱黃色瘤及早發冠心病（coronary heart disease，CHD）風險增加等是HoFH典型的臨床特征；如未經治療，HoFH患兒青少年期即可發生CHD，在30歲之前就可能因心肌梗死而死亡，甚至有發生猝死的風險[3]。本研究擬分析1個FH家系LDLR基因突變及外周血單核細胞表面LDLR的表達情況。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年10月西安交通大學附屬兒童醫院確診的1例LDLRE140K突變致HoFH先證者及其家系成員共5例。HoFH診斷標準參照歐洲動脈粥樣硬化協會（European Atherosclerosis Society，EAS）2014年發布的HoFH管理指南[4]。臨床診斷標準：治療前LDL-C＞13 mmol/L或治療后LDL-C＞8 mmol/L，且10歲之前出現皮膚或肌腱黃色瘤或父母LDL-C水平與雜合型FH一致。先證者基因診斷結果為LDLR基因純合突變c.418G＞A（p.E140K）[5]。基因診斷標準：LDLR、APOB、PCSK9和LDLRAP1基因檢測到明確的2個突變位點。本研究經西安交通大學附屬兒童醫院醫學倫理委員會批準，所有對象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集先證者及其家系成員臨床資料，包括病史和體格檢查、生化檢測（血脂、心肌酶、肝腎功等測定）、心電檢查結果和超聲心動檢查結果等。

1.2.2 外周血單核細胞表面LDLR表達的檢測 采集所有對象外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。取1 mL置于流式上樣管中，加入紅細胞裂解液（自配），溶血15 min，然后670×g離心5 min，棄上清，向底部的白細胞層加入磷酸鹽緩沖液（ phosphate-buffered saline，PBS），充分混勻，制備成白細胞懸液。在白細胞懸液中加入CD45-PerCP抗體、CD14-FITC抗體（美國Novus Biologicals公司）和LDLR-APC抗體（美國BD公司），標記有核細胞，渦旋混勻，室溫避光孵育15 min ，加入1 mL PBS洗滌細胞，670 ×g離心5 min，棄上清，最后加入500 μL PBS，渦旋混勻，采用FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）檢測。使用Cellquest軟件（美國BD公司）進行分析，以設邏輯門的方法在CD45/SSC散點圖中根據CD14表達強弱的不同，設門圈出單核細胞，每個樣本設同型對照，并采集10 000個細胞進行數據分析[6]，用平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）單核細胞LDLR表達水平表示。

1.3 統計學方法

采用SigmaStat 3.5軟件進行統計分析。不同家系成員之間各項目的比較采用t檢驗。采用Pearson相關分析評估LDLR與血脂項目之間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 先證者及其家系成員的臨床表型分析

先證者（HoFH患兒）TC和LDL-C水平較高，臨床表型重，確診時已經出現心血管損傷，頸部超聲提示雙側頸動脈及升主動脈內膜增厚并粥樣硬化，心臟彩超提示主動脈瓣增厚、鈣化，并出現主動脈關閉不全表現，膝關節可見黃色瘤。先證者父母均為HeFH患者（攜帶雜合突變），TC和LDL-C水平均高于與未攜帶突變（野生型）的家系成員（先證者大姨）（P＜0.05）。先證者父親出現角膜環，雙側頸動脈硬化，有斑塊形成；先證者母親尚未發現動脈粥樣硬化及冠心病表型。見表1。

表1 先證者及其家系成員基因型和血脂水平、臨床表型信息

2.2 先證者及其家系成員單核細胞表面LDLR表達

先證者（LDLRE140K純合型）、先證者父母（LDLRE140K雜合型）及先證者大姨（野生型）單核細胞表面LDLR的MFI分別為68.75、126.82、147.6、437.56。見圖1、圖2、圖3。

圖1 先證者及其家系成員單核細胞表面LDLR表達散點圖

圖2 先證者及其家系成員單核細胞表面LDLR表達峰圖

圖3 先證者及其家系成員單核細胞表面LDLR表達

2.3 先證者及其家系成員單核細胞表面LDLR表達與TC、LDL-C的相關性

Pearson相關分析結果顯示，在LDLRE140K基因突變家系成員中，外周血單核細胞表面LDLR水平與TC、LDL-C均呈負相關（r值分別為-0.682、-0.664，P＜0.05）。

3 討論

FH是一種常染色體顯性遺傳性疾病，主要臨床表現為LDL-C水平明顯增高、皮膚黃色瘤及早發CHD，可分為HoFH和HeFH 2種類型。目前，由于臨床對FH認識不足，其診斷率較低，尤其是兒童HF的管理仍處于探索階段[1]。日本動脈粥樣硬化學會聯合工作組發布的兒童FH指南[7]指出，早期診斷和早期干預可更好地改善FH患兒的預后。

本研究檢測了1例LDLRE140K純合突變的HoFH患兒及其家系成員的外周血單核細胞表面LDLR表達水平，結果顯示，單核細胞表面LDLR的MFI呈LDLRE140K純合型＜LDLRE140K雜合型＜野生型的趨勢，提示HoFH患兒LDLR表達量顯著降低，LDLRE140K變異對其攜帶者單核細胞表面LDLR的表達有顯著的抑制作用，且純合型的抑制作用強于雜合型。FH的致病基因主要包括LDLR、APOB和PCSK9，致病基因通過影響LDLR的表達、結構或功能造成機體膽固醇代謝障礙，最終導致FH[8-9]。LDLR是一類由高爾基體加工后轉運到細胞表面的跨膜糖蛋白，功能是介導LDL的攝取，參與LDL代謝過程，并通過LDL循環調控機制保證機體膽固醇水平的動態平衡[10-11]。在所有FH的致病基因中，LDLR基因的突變頻率最高，占總突變頻率的90%以上[12-13]。在高膽固醇血癥患者中可檢出不同的LDLR基因變異[14-16]，但LDLR基因變異對攜帶者細胞表面LDLR表達的影響的相關研究較少。RODRíGUEZ-JIMéNEZ等[17]的研究結果顯示，LDLR基因變異可導致LDLR表達和活性降低。LDLR基因對LDLR的影響主要體現在表達量和內化活性功能2個方面[18-19]。本研究結果顯示，LDLRE140K突變可影響LDLR的表達量，即通過下調細胞表面LDLR的表達引發FH。后續將研究LDLRE140K突變對LDLR功能的影響。

本研究結果顯示，先證者（LDLRE140K純合突變）、先證者父母（LDLRE140K雜合突變）、先證者大姨（野生型）外周血單核細胞LDLR表達量依次升高，血清LDL-C及TC水平依次降低；先證者的臨床癥狀最重，先證者父親的臨床癥狀相對較輕。提示LDLRE140K突變明顯下調了單核細胞表面LDLR的表達，且下調程度與基因型有關。有研究結果顯示，LDLR缺乏引起的動脈粥樣硬化脂蛋白譜可被視為動脈粥樣硬化的危險因素，HoFH患者淋巴細胞表面LDLR表達量與血清LDL-C、載脂蛋白B水平呈顯著負相關（r值分別為-0.700、-0.667，P＜0.01），LDLR的殘留表達是LDL-C水平的主要決定因素[19-20]。在難以治療的FH患者中，通過中和抗體等方式增強LDLR表達可顯著降低血脂水平，有助于改善FH患者的心血管狀況。因此，檢測外周血單核細胞表面LDLR水平可為FH患者的血脂評價與管理提供重要參考。

綜上所述，LDLRE140K突變可下調FH患者LDLR的表達，且下調程度與基因型有關。檢測LDLR基因突變及外周血單核細胞LDLR的表達有助于FH的早診早治，減少FH患者心血管并發癥的發生。