非培養表皮細胞對比毛囊濾泡細胞懸液移植治療穩定型白癜風的Meta分析

孫曉明，陳菊萍，劉 軍，齊丹丹，楊鏡徽，馬 江

（揚州大學附屬醫院皮膚科，江蘇 揚州 225009）

白癜風是一種由于表皮基底層黑素細胞的喪失導致的一種獲得性色素沉著障礙性疾病，對患者尤其是膚色較深的患者造成極大的心理負擔和生活質量的影響。白癜風主要分為節段性和非節段性［1，2］。白癜風的治療包括藥物治療，光療和手術治療等，在大多數個體中這些治療只能使部分皮損復色［3，4］。手術治療是藥物治療無效的穩定型白癜風的一種重要的替代治療方式，通過將完整的黑素細胞從色素沉著部位轉移到脫色部位，從而恢復皮損處色素沉著［5］。手術治療包括組織移植方法和細胞移植方法，組織移植包括薄皮表皮移植、全厚度穿孔移植、吸皰移植和表皮收獲系統，對于小面積藥物治療無效的穩定型白癜風皮損復色效果較好。細胞移植采用未培養的表皮懸液和培養的黑素細胞懸液細胞移植，細胞移植可以很容易地治療大面積的脫色。

針對大面積的白癜風皮損，組織移植作為供體的代價將十分巨大，如何通過使用最少的供體，達到最優的復色效果，是大面積白癜風手術治療的關鍵。細胞懸液移植治療可以有效提高供體的作用面積，包括非培養表皮細胞懸液和培養的表皮細胞懸液治療［6］。

目前關于白癜風手術治療的系統評價尚無針對NCES（non-cultured epidermal cell suspension，NECS）和HFCS（hair follicular cell suspension，HFCS）兩種方法具體的Meta分析［6，7］，本文針對NECS和HFSCS兩者的復色效果進行Meta分析并對其不良反應及優劣進行討論。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索 本文在知網萬方等中文文獻庫中未檢索到關于NECS和HFCS單獨比較的RCT（randomized controlled trial，RCT）研究， 故檢索流程圖僅限于英文文獻，檢索數據庫為pubmed，Cochrane Library，Web of science，從Pubmed數據庫MeSH中匹配“Vitiligo”及“Graft”的相關詞匯，得到英文數據庫的檢索策略，為（（Transplants）OR（Transplant）OR（Grafts）OR（Graft）OR（Tissue Transplants）OR（Tissue Transplant）OR（Transplant，Tissue）OR（Transplants，Tissue）OR（Tissue Grafts）OR（Graft，Tissue）OR（Grafts，Tissue）OR（Tissue Graft）OR（Cell Transplants）OR（Cell Transplant）OR（Transplant，Cell）OR（Transplants，Cell）OR（Organ Transplants）OR（Organ Transplant）OR（Transplant，Organ）OR（Transplants，Organ）OR（Organ Grafts）OR（Graft，Organ）OR（Grafts，Organ）or（Organ Graft））AND （（vitiligo） OR （leukoderma）OR（Hypopigmentation）OR（Hypomelanosis）OR（Hypomelanoses））

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準 ① 研究對象：確診為穩定型白癜風且有符合面積皮損的白癜風患者。 ② 研究類型：RCTs研究，包括自身對照與對照組對照。③ 干預措施：NECS與HFCS相比。④ 結局指標：皮損恢復面積百分比。

1.2.2 排除標準 ① 非RCT研究。② 數據不全或缺失的文獻。③ 動物研究或重復文獻。

1.3 文獻數據提取 根據納入和排除標準嚴格篩選文獻。首先通過閱讀文獻題目和摘要進行初篩，隨后閱讀初篩后的所有文獻，篩選符合要求的文獻納入研究。本操作由兩名獨立的作者進行，兩人完成后進行匯總分析，對有爭議的文章，邀請第三人進行評判，共同商討，完成文獻的納入。

1.4 文獻質量評估 納入研究的質量評估按照Cochrane 偏倚風險評估系統進行。 偏倚風險評估等級分為：高 /低風險偏倚和不明確三個等級。 偏倚評估類型有：選擇、實施、測量、隨訪、報告、其他這幾個方面的偏倚和分配隱藏。主要來源包括：如何制定產生隨機序列的方式；實驗和結局評估者和受試者是否采用盲法；研究結局數據是否完整等幾部分。上述評估由兩名作者獨立完成后匯總。

1.5 統計學方法 應用軟件Revman5.4做meta分析。對皮損恢復比率以及不良反應進行分析。采用比值比（OR）和 95%可信區間（CI）為分類變量的效應指標。檢驗異質性的指標用I2判斷。當I2≤40%時，則應用固定效應模型分析數據；當I2＞40%時，根據研究之間是否具有統計學和臨床異質性以及結果的差異有無統計學意義，判斷是否進一步分析其異質性來源；決定是否采用隨機效應模型進行分析。發表偏倚用漏斗圖檢驗。

2 結果

2.1 文獻檢索結果 經檢索得到53篇相關文獻，閱讀全文討論后獲得符合納入標準的文獻6篇。共納入NECS組104處皮損，HFCS組99處皮損。文獻篩選流程圖見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

2.2 納入研究的基本情況（見表1） NECS：非培養表皮細胞懸液移植；HFCS：毛囊濾泡細胞懸液移植。

表1 納入文獻基本信息

2.3 文獻的質量評價 采用Revman5.4自帶的Cochrane質量評價表對納入的RCT文獻進行評價，嚴格按照 Cochrane 評價條目進行。由兩位作者獨立完成匯總。評價結果見圖2。

圖2 偏倚風險評估表

2.4 療效分析 六篇文獻中的NECS與HFCS組中，年齡，性別，皮損面積等基線數據均無統計學意義（P＞0.05），各組數據之間具有可比性。

本文納入的6篇文獻中，評價指標為二分類變量，即術后皮損復色面積與術前皮損面積的百分比，規定復色百分比＞75%為顯效11，對納入文獻的顯效率進行匯總分析（見表2）。使用隨機效應模型（異質性檢驗I2=31%）進行分析。總顯效率合并RR=1.39，95%CL：（1.14，1.70），Z=3.22；P=0.001 ＜ 0.05，顯示總顯效率的P值有統計學差異。表明NECS組效果優于HFCS組。

表2 復色程度（±s）

表2 復色程度（±s）

作者 NECS組 HFCS組D.R.Gunaabalaji ［8］ 61.58±42.68 14＞75% Re 78.68±30，.03 P=0.1618 10＞75% Re C.Singh［9］＜50%：1 50%-74%：1 75%-89%：2 90%-100%：20＜50%：2 50%-74%：3 75%-89%：3 90%-100%：15 B.M.El-Zawahry ［10］＜50%：3 50%-74%：5 75%-100%：2＜50%：3 50%-74%：1 75%-100%：2 R.Pangti ［11］ 75%-100%：9 75%-100%：8 N.Donaparthi ［12］ 26%-50%：3 75%-100%：27 0%-25%：9 26%-50%：7 51%-75%：1 76%-100%：13 A.M.Hamza ［13］0%-49%：4 50%-74%：4 75%-89%：1 90%-100%：1 0%-49%：2 50%-74%：5 75%-89%：2 90%-100%：1

2.5 不良反應及患者選擇 納入文獻中未統計不良反應為極個別情況，故未記錄不良反應事件的發生率。在納入文獻中報道的不良反應中，疼痛，瘢痕為兩者共同出現過的不良事件。其中NECS單獨報道的不良事件有移植部位周圍暈，兩者均為少數事件，發生頻率無統計學差異。

其它非RCT研究中報道出現的不良反應為NECS：受體部位：顏色不匹配、色素沉著、邊緣暈、感染、斑駁色素沉著、灼痛不適。供體部位：Koebner現象、感染、增生性疤痕、色素沉著；NCFS：受體部位：顏色不匹配、色素沉著、感染、瘙癢、干燥。供體部位：色素沉著、增生性疤痕、感染。

2.6 敏感性分析及發表偏倚 根據總顯效率的異質性做了敏感性分析，發現剔除“Navya Donaparthi 2016”這篇文獻后，總顯效率的異質性I2=0%，重復閱讀文獻后認為異質性的來源在于該實驗樣本量較大，以及作者所訴毛囊黑素細胞提取的數量有限。應用漏斗圖進行評價，其中Ashraf 2019和 Bakr Mohamed 2017兩篇，由于樣本量較小，導致偏倚。剔除以上三篇文獻后進行分析P=0.04＜0.05，顯示總顯效率的P值依舊有統計學差異，但由于剔除后樣本量的大大減少，出于科學研究的嚴謹性，還需要更進一步RCT實驗研究。

圖3 總有效率漏斗圖分析

3 討論

非培養表皮細胞懸液包括非培養表皮細胞懸液移植和毛囊濾泡細胞懸液移植。非培養表皮細胞懸液移植引入于1992年［14］，主要采用從供區（一般為大腿內側或臀部）取薄層皮膚移植物，使用胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液培養皿，經過孵育，分離，離心獲得含有黑素細胞的細胞懸液均勻涂抹于使用CO2激光或人工擦皮至點狀出血的白癜風皮損表面固定［15］。在非培養的表皮細胞懸液中，角質形成細胞與黑素細胞沒有分離，角質形成細胞有助于提供維持和促進黑素細胞生長和色素同質性的因子。

毛囊濾泡細胞懸液又名濾泡外根鞘懸液（NCEHF-ORS-CS），移植于2009年［16］進行供體部位的改進，相較于非培養表皮細胞懸液移植，不同之處在于供區為毛囊，是黑素細胞及其前體細胞的重要儲存庫。將供區毛發修剪到約2毫米，局部浸潤麻醉。一般選擇枕部頭皮約50個毛囊，使用一次性1毫米皮膚活檢穿刺器獲取卵泡單位，沖頭沿著毛囊的方向旋轉，直到到達真皮中部。然后，用細鑷子握住毛干周圍的皮膚，輕輕將毛囊拔出。然后，使用胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液培養皿37℃培養后，用PBS溶液中和，然后離心獲得含有黑素細胞的細胞懸液均勻涂抹于使用CO2激光或人工擦皮至點狀出血的白癜風皮損表面固定［17］。

圖4 偏倚風險評估表

圖5 NECS與HFCS的有效率比較

圖6 剔除后NECS與HFCS的有效率比較

毛囊和表皮作為皮膚組織中產生色素的細胞來源，理論上講，在細胞群體組成、黑素細胞表型和功能以及細胞微環境等方面，毛囊被認為是治療白癜風更有利的細胞來源。

首先，毛囊的外層被稱為外根鞘（ORS），在中下部包含一個由分化差的無色素性或淺色的黑素細胞組成的黑素細胞庫，其中的二氫氧苯丙氨酸（dihydrooxyphenylalanine，DOPA），是黑素發生的中間產物。黑素細胞干細胞（melanocyte stem cells，MeSCs）是毛囊內的主要黑色素細胞類型，是一種不同于活性黑色素細胞的DOPA陰性的頭發黑素細胞群體。體外研究表明，MeSCs具有很高的增殖潛能，可在白癜風病灶的再變色過程中作為黑素細胞庫，其原位時并不活躍，在遷移到表皮上層時，通過逐漸轉變為DOPA陽性的黑色素細胞，積極產生黑色素并使白癜風皮膚變色。據推測，白癜風患者毛囊中的黑素細胞干細胞由于其表面缺乏黑素細胞抗原而躲過了T細胞介導的凋亡而未受損傷。此外，表皮和頭發黑色素細胞表達不同的抗原譜，因此它們在白癜風和斑禿中優先被不同的循環抗體靶向。提示與表皮黑素細胞相反，毛發黑素細胞不表達白癜風相關抗原。這種差異可能在理論上使毛囊比皮膚表皮更能補充失去的黑素細胞，因為毛囊衍生的黑素細胞可能不太容易受到受體生態位中病理微環境的影響。其次，與表皮黑色素單位（每36個角質細胞對應1個黑素細胞）相比，毛囊黑色素單位（平均每5個毛球角質細胞對應1個黑素細胞）中的黑色素細胞密度更高，這似乎是毛囊治療白癜風的另一個優勢。不僅如此，毛囊衍生的黑色素細胞更大，更樹突。它們具有更廣泛的高爾基體和粗面內質網以及更大的黑素體，因此具有更高的合成能力。最后，除了毛囊與表皮細胞懸液共有的黑素細胞、角質形成細胞和角質形成干細胞外，毛囊來源的細胞懸液還含有可能影響色素再生過程的細胞和分子成分。毛乳頭被毛囊（底部毛囊的膨大部分）包圍，是間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和毛發生長和黑色素形成所必需的生長因子的來源。此外，由于在采集毛囊時可能會提取周圍的一小部分真皮，真皮駐留的間充質干細胞也可能存在于毛囊來源的細胞懸液中。結果表明，真皮間充質干細胞可能通過抑制周圍CD8 T細胞對白癜風病變重新著色的負面作用而增強細胞移植的療效［18］。

然而經過系統的RCT實驗研究，毛囊細胞懸液的復色并未如理論般優于表皮細胞懸液。可能存在的原因包括：毛囊色素沉著依賴于黑素細胞、無黑色素細胞和它們在毛囊膨大中的前體之間復雜的相互作用，與只有分化的黑素細胞的表皮相比，這是很難恢復的。且毛囊中的黑素細胞干細胞受角化細胞、真皮乳頭細胞以及毛囊外信號的調控，其多尺度的調控機制比表皮重生化復雜得多。細胞懸浮液無法補充毛囊膨出區域的黑素細胞干細胞及其他復色需要的相關生長因子如角質形成細胞來源的生長因子的丟失及缺乏，因而導致了低于預期的復色效果。

兩者方法的主要差別在于供體的選擇，NECS選取著色正常的皮膚，操作方法相對于HFCS更為簡單，主要存在的問題為術后邊緣暈及供體部位Koebner現象，NECS發展較為成熟，相對于培養的表皮細胞懸液，非培養表皮細胞懸液的經濟成本相對更低，操作也更為簡便。雖然非培養表皮細胞懸液供受體比例可達1∶10，低于培養的表皮細胞懸液的1∶60［19］，但黑素細胞培養費時昂貴且需要專門的細胞培養實驗室和高度刺激的培養基堿性成纖維細胞生長因子。對于不熟練提取毛囊細胞的術者，可能是一種更為穩妥的選擇。

HFCS選取毛囊卵泡單位，只由幾個穿孔獲得，從而能夠快速愈合，但HFCS方法需要準確識別毛發生長初期的毛囊，在采集前需要剃掉或修剪頭皮毛發，且存在毛囊橫切從而大大減少懸液中的復色相關細胞的風險，固而HFCS對操作者要求較高。本文收集的RCT文獻中，就有一篇文章因為毛囊提取單位的質量及數量問題，導致復色程度的大幅下降。并且，HFCS復色速度較NECS更加緩慢。在針對患者的調查問卷中，除Ashraf2019外，患者都更傾向于選擇NECS，其原因可能并不僅僅如Ashraf2019中所說，是因為NECS復色速度較HFCS更快導致。且HFCS為近期提出的更為新穎的技術，不排除發表偏倚的存在，但恰恰是因為HFCS是新技術，在毛囊提取和創造補充復色需要的生長因子以及如何保留干細胞的活性，都是需要進一步探索的方面。通過HFCS操作的進一步提高和毛囊研究的進一步升化，HFCS可以擁有更為廣闊的前景。也有研究顯示NCES和NCFS聯合使用相對于單獨使用NCES或HFCS，可提高重著色率。其優越性在于表皮細胞懸液中含有干細胞因子和堿性成纖維細胞生長因子，這可能刺激了濾泡細胞懸液中存在的干細胞的增殖或許這會成為細胞懸液移植更為有效的途徑［20，21］。在Meta分析中，當包括Navya2016文獻時I2=31，P＜0.05，雖然Navya2016是異質性的主要來源，但從異質性來源的原因也可以說明HFCS 操作的困難程度更高即對術者的要求更高。當排除Navya2016文獻及兩個小樣本實驗Ashraf 2019和 Bakr Mohamed 2017后，森林圖中的顯效率傾向于NECS，P =0.04＜0.05有統計學意義。但由于剔除后樣本量大大減少，出于對實驗的嚴謹性，針對NECS和HFCS的優劣性問題，還需要更多臨床RCT的檢驗。

關于NECS和HFCS的優劣，無論是患者滿意度還是復色程度，目前更傾向于NECS。但出于科研的嚴謹性還需要更多RCT的比較，不論是NECS還是HFCS，對于大面積的藥物難治性穩定性白癜風都有著更好的療效和更優的性價比，相對于其他手術方案，對供體的需求也更小，是白癜風手術治療的一大重要方法，值得推廣。HFCS作為一種更為新穎的非培養細胞移植方案，還需要更加深入的研究，關于毛囊提取的方法，細胞提取的方法，如何才能發揮毛囊濾泡單位更大的作用都是HFCS可以繼續優化的方向。