森林土壤細菌群落分子生態網絡分析研究進展

王玉鳳，覃 林

(廣西大學 林學院，廣西森林生態與保育重點實驗室，廣西 南寧530004)

1 引言

森林是陸地生態系統的主要載體[1]。土壤微生物是森林生態系統的重要組成部分,而土壤細菌又是數量最多和種類最豐富的微生物群體之一[2,3]，在生態系統物質轉換、能量流動和生物地球化學循環過程中扮演著不可或缺的角色，如調解植物凋落物分解和土壤養分循環等過程，對維持生態系統結構和功能穩定性方面起著重要作用[4]。

生態網絡是指一種對生態系統中生物地球化學循環與能量流動進行模擬和構建的拓撲結構模型，生態網絡分析則表示對生態網絡進行分析歸納的方法以及研究的系統理論，也是系統生態學中一個嶄新的分支學科，在20世紀70年代后期引起科研人員的注意[5，6]。近年來生態網絡分析被廣泛應用于生物學分析，如種群關系網絡、蛋白質互作網絡和基因調控網絡等，已成為生態學尤其是微生物生態學新的研究熱點[7]。分子生態網絡是基于物種與功能水平的一種生態網絡類型[8]。細菌分子生態網絡則是指以細菌細胞為節點有序組合而成的生物界的一種無尺度網絡，是自然生態系統中細菌及其基因組發揮功能活性的主要形式[9～11]。分子生態網絡分析可以幫助我們更方便地理解一個生態系統中發揮主要作用的細菌種屬，因為一個模塊中相互聯系的節點所對應的細菌常常是功能上緊密聯系的、可以實現特定功能或者生態過程的細菌種群[12，13]。從生態學的角度系統地研究細菌群落分子生態網絡,將全面真實地揭示土壤細菌群落生命活動的法則, 闡明細菌之間能量和物質傳遞規律,進一步挖掘和發現土壤細菌群落的潛力[14～17]。

為了更好地理解森林土壤細菌群落的構建和維持機制,本文以森林土壤細菌為重點,總結了分子生態網絡的起源、構建方法及其特征，以及現階段研究存在的問題等，旨在梳理最新研究進展和提出可能的研究途徑,為深入認識森林土壤細菌群落相互作用關系的形成機制提供新的研究思路。同時，開展森林土壤細菌群落分子生態網絡分析，還可以幫助我們鑒定土壤細菌群落中的關鍵物種，對于深入了解森林土壤細菌的生態功能具有重要作用。

2 分子生態網絡分析方法

2.1 分子生態網絡的起源

20世紀70年代初Hannon[18]首次將Leontief[19，20]所研發的投入-產出模型實踐于自然生態系統中生物地球化學循環與能量的流動的研究[21],這時生態網絡分析(Ecological Network Analysis， ENA)思想初步成形[22]。生態網絡分析方法不僅可以定量分析生態網絡中能量流動的數量和方向，還可以分析網絡中物種之間的相互作用,從而揭示生態系統中物種種群行為的完整性與其相互作用的復雜性[23]。之后，1976年Patten[24]率先發表了生態網絡分析方法的論文，同年Finn[25]在Hannon[18]的生態網絡分析方法的基礎上做了一些改進, 即提出了一系列量化生態系統拓撲結構的指標, 包括生態系統物質流通量、平均路徑距離和模塊化指數等, 這極大地改善和促進了生態網絡分析方法的形成與發展。到了20世紀70年代末, 又因研究的目的性與需求性不同,生態網絡分析方法分為了上升性分析以及環境元分析[26，27],分別從兩個方面展開系統研究，其中上升性分析是從生態網絡整體視覺來進行探究，即基于獲得的信息理論來探究生態網絡中物質循環與能量流動的整體表現[6],而環境元分析則從生態網絡內部物種間相互作用角度來進行探討，即分析深入至生態網絡內部的物種,基于生態網絡的模塊成員間分布模式,從而進一步分析生態網絡內部復雜的網絡拓撲結構與潛在功能間的關系[28]。

分子生態網絡分析(Molecular Ecological Network Analysis，MENAs)是指基于數學理論模型的一種分析方法，它可以分析復雜生態系統中生物群落內物種間的相互作用關系(協同、合作、競爭或捕食等)[7]。在物種種間與潛在功能水平上, 基于16S r RNA、18Sr RNA或ITS等擴增子測序數據以及基于隨機矩陣理論(random matrix theory-RMT)，以Pearson或Spearman等相關系數的構建方法構建分子生態網絡(MENs)又稱為生態關聯網絡[29]。近年來，研究人員也將此分析方法引入到了細菌群落結構的分析，為土壤生態中的細菌群落結構分析開辟了一個新的天地。在細菌分子生態網絡中, 大部分的細菌只參加一種或兩種反應, 表現出一種或兩種生理功能, 但少數細菌則參與多種反應,表現出多種生理功能, 形成分子生態網絡的核心細菌群系[30]。因此，分子生態網絡分析在細菌群落的結構構建、細菌群落之間的相互作用關系、關鍵種群的鑒別以及細菌對環境因素變化的響應等方面的研究中獲得了一個舉足輕重的地位[31～33]。近年來，分子生態網絡分析已廣泛應用于不同土壤類型的細菌群落研究，如農田[34,35]、草地[36]等。

2.2 分子生態網絡的構建方法及其特征

目前針對分子生態網絡的構建方法主要有兩種。其一，在簡單生態系統中是基于物種間的共現性或者相關性(相似性、相關關系、交互信息)來預測兩兩之間的相關關系；其二，在復雜生態系統則采用線性回歸等方法來預測兩個及以上的物種之間的相互作用[37]，然后利用可視化軟件將預測關系進行數學轉化，如CoNet[38]、Cytoscape[39]、Gephi[40]以及R 語言的igraph、WGCNA 和vegan 包[41]等，從而揭示細菌群落對生態系統功能構建、維持以及演替的影響。除此之外，所有這些分子生態網絡構建方法和統計分析工具已被整合到一個全面的分子生態網絡分析平臺(MENAP)上，該平臺是開放的(http://ieg2.ou.edu/MENA)，具體使用操作方法見圖1[42]。

分子生態網絡的基本拓撲性質主要包括節點、連接、平均聚類系數、平均連接度、平均路徑距離、模塊化指數和關鍵節點等信息(表1)。節點可代表現實生態系統中微生物、基因、蛋白質和環境因子等；而連接則代表它們之間的相互作用, 包括互利共生、競爭和捕食、拮抗或致死等[43～45]。細菌分子生態網絡分析的主要優點有以下方面：第一，網絡中能夠展現位于生態系統中的細菌彼此之間的相互作用關系，進而反映細菌群落種間關系的系統特征(eco-systembiology)[46,47]，如用平均路徑距離(averagepathlength)、模塊化指數(modularity)、平均連接度(Average connectivity)和平均聚類系數(Averageclusteringcoefficient)等拓撲學性質參數來描述該網絡的規模大小，以及網絡中物質循環和能量流動的流通程度[48]；第二，網絡中具有高連接度(highlyconnectednodes)的細菌通常被認為是“關鍵細菌”(keystonebacteria)[49,50]，這類細菌在維持細菌群落結構的整體穩定性中發揮著關鍵作用，如不慎丟失或失去其關鍵作用則會導致整個細菌分子生態網絡結構解散或重組[51,52]；第三，網絡的模塊結構(modules)與土壤理化性質因子之間的相關性可用來指示哪些重要模塊成員(細菌)具有類似生態學功能或共享生態位(niches)[16,53]；第四，網絡的穩健性(robustness)大小可用來表征細菌群落分子生態網絡結構的穩定性和其抗干擾性能的優劣[54～56]，穩健性大的網絡結構不易因外來因素(如生態入侵、季節變化、重金屬侵蝕等)所影響，進而維持所在生態系統的穩定性；第五，網絡的模塊特征基因(eigengene)分析可用來表征細菌群落與環境因子(如土壤理化性質因子)之間的相關性，從而判斷特定細菌群落的生態學功能[49]；第六，利用分子生態網絡可探究分析一個生態系統轉變成另一個生態系統時細菌分子生態網絡潛在功能的變化情況[57,58]。

2.3 分子生態網絡分析面臨的挑戰

分子生態網絡分析目前依然是一項新穎而又具有挑戰性的任務。Faust[71]于2021年提出了當今分子生態網絡建設與分析面臨的十大挑戰，具體如下：①分類群的相互作用是否影響細菌群落組成(Do taxon interactions influence microbial communitycomposition)？②應如何對豐度數據進行預處理(How should abundance data be preprocessed)？③如何處理稀有類群(What to do with rare taxa)？④如何處理環境因素(How to deal with environmental factors)？⑤高階交互作用(Higher-order interactions)怎么處理(What about higher-order interactions (HOIs))?⑥如何在計算機上評估細菌網絡構建(How to evaluate microbial network construction in silico)？⑦如何在生物數據上建立細菌網絡構建的基準測試(How to benchmark microbial network construction on biological data)？⑧我們能從節點中學到什么(What can we learn from the hairballs)？⑨如何識別核心網絡(How to identify core networks)？⑩細菌網絡在多大程度上代表了生態系統(How well do microbial networks represent ecosystems)？

3 森林土壤細菌群落分子生態網絡分析的現狀

分子生態網絡分析作為一種系統分析工具，利用其從整體上探究森林土壤細菌群落的構建和維持機制有助于更深入了解土壤發生、發展和發育的整個過程，具有不可忽視的發展前景。

Ma等[72]于2015年率先在國內將分子生態網絡分析方法運用于森林土壤細菌群落的研究中，他們在我國東部地區從海南省到黑龍江省共采集了110個森林土壤，通過土壤細菌的高通量測序數據來構建分子生態網絡，研究發現土壤細菌分子生態網絡的拓撲特征具有明顯的地帶性差異，而不同細菌類群的共存關系模式也有顯著差別；同時，網絡拓撲特征分析表明我國北方土壤菌群共存關系更普遍，但相互影響強度卻較南方土壤菌群更小；土壤有機質、鐵、氮與pH值是影響分子生態網絡的重要環境因素；由于細菌間相互作用比細菌多樣性對土壤功能具有更大影響，這一發現為理解土壤細菌的地理分布模式及其對土壤功能的影響提供了研究新途徑。該研究將系統生物學中網絡的概念應用于高度復雜的環境樣本是該領域發展的重要一步。其雖研究了土壤中網絡拓撲特征與環境因子之間的相關性，網絡中的關鍵物種對其他群落組成部分產生的巨大影響，但是輸出的分子生態網絡是統計相關性，并不直接證明細菌間的相互作用[73]。因此，未來的分子生態網絡分析應側重于更合理的推斷方法，即與功能預測聯系起來，對于更好地了解土壤細菌群落中的相互作用至關重要。

Wood等[57]采用分子生態網絡分析方法，構建了馬來西亞土壤細菌從原始雨林到油棕林(oil palm plantation)和次生林的分子生態網絡，然后對其進行了比較分析，發現次生林和原始雨林之間的細菌群落分子生態網絡結構存在顯著差異；Tian 等[58]構建了中國東部3700 km南北向樣帶的原始林和次生林土壤中的細菌分子生態網絡，研究發現原始林的細菌分子生態網絡比次生林更復雜，即細菌在原始林中具有更大的生態位共享和更多的相互作用；Sunil 等[74]對挪威白樺林(Betula pubescens)的4個不同土壤深度(0 cm、0～5 cm、5～15 cm、15～30 cm)中細菌群落分子生態網絡的研究發現，表層比底層的相關性更多，網絡結構更復雜，且差異顯著，表明土壤深度對細菌相互作用有重大影響；焦克等[75]研究藏東南色季拉山暗針葉林帶表層(0～20 cm)和底層土壤(40～60 cm)細菌群落分子生態網絡結構，發現細菌分子生態網絡中正相關連接的比例均隨土壤深度增加而增加，底層土壤細菌分子生態網絡的平均連接度和平均聚類系數均高于表層土壤，說明細菌分子生態網絡隨土壤深度的增加而變得更復雜。李前等[76]在南方紅壤區馬尾松林下構建了 3個不同處理水土流失防治措施的土壤細菌群分子生態網絡,研究表明，水土流失防治措施實施后土壤細菌群落結構發生明顯變化，分子生態網絡規模增大，細菌間互作強度以及細菌群落結構的穩定性提高。上述采用分子生態網絡分析的研究極大地豐富了人們對各種森林土壤生態系統中細菌共生模式的理解。然而，對于細菌分子生態網絡結構的差異是否對細菌功能產生影響仍然知之甚少。蘭國玉等[77]以海南省典型橡膠林(rubber plantation)和熱帶雨林為研究對象，構建了土壤細菌群落的分子生態網絡并分析其主要驅動因素，研究發現橡膠林的細菌分子生態網絡結構比熱帶雨林簡單，土壤pH值、土壤養分及季節變化是分子生態網絡結構的主要驅動因素。最后，研究中還將分子生態網絡分析與宏基因組測序數據結合起來構建了細菌和功能相關性網絡，從而揭示了細菌組成與功能之間的相互作用。該研究為了解和管理中國與其他地方熱帶森林中的細菌群落提供重要借鑒，具有方法論意義。

4 森林土壤細菌群落分子生態網絡分析的展望

森林土壤細菌作為森林生態系統物種豐度和多樣性最高的生物之一，探究其群落構建和維持機制對于保護森林生態系統穩定性具有重要意義。然而，與宏觀生態學研究相比，對土壤細菌群落分子生態網絡結構的了解是有限的，且缺乏大尺度的相關研究，尤其是國內關于大尺度人工林以及自然保護區森林土壤細菌群落的報道較少。因此，亟需要在大尺度條件下對森林土壤細菌群落的分子生態網絡結構開展系統的研究，以期彌補目前研究的不足和進一步完善該分析方法。結合國內外的發展前沿, 今后應重點關注以下2方面的研究:①模塊化拓撲作用與特征基因網絡分析相結合。在確定模塊和子模塊后，特征基因分析對于揭示高階組織和基于網絡拓撲識別關鍵群體非常重要；②分子生態網絡分析與功能預測相結合。盡管分子生態網絡分析具有很多優點，但畢竟只是由數學模型推斷得到的，因此真實情況中所有的網絡構建方法都不能區分出真正的細菌相互作用和非隨機的生態過程，即使用分子生態網絡分析來研究細菌相互作用帶有強烈的推測性，因此需要將其和其他技術相結合應用，以獲得更全面的認識。