缺氧誘導因子-1ɑ在缺血性心臟病治療中的研究進展

翟淼浡 杜鑫 董彬昌 徐會圃

濱州醫學院附屬醫院心血管內科，濱州 256600

近年來，隨著人們生活水平的提高及生活習慣的改變，冠心病的發病率逐年上升，并有發病年齡年輕化的趨勢，已成為我國中老年人群中常見病及主要死亡原因。急性心肌梗死是冠心病中最危重的一種，嚴重威脅著人們的健康。心肌梗死造成心肌細胞的死亡和心功能的損傷。隨著急癥溶栓和急診經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）等技術的成熟和普及，急性心肌梗死的病死率呈逐年下降趨勢，但心肌梗死所引起的心功能損害已成為臨床心血管內科醫師與心肌梗死患者所面對的主要問題。在急性心肌梗死中，心肌細胞的保護、梗死部位血管的再生、改善心肌細胞代謝已成為當前急性心肌梗死治療策略中的重要組成部分［1］。在此背景下，如何在缺血、缺氧環境中盡可能保護心肌細胞已成為目前急性心肌梗死治療的重要研究方向。

急性心肌梗死的主要病理過程是心肌細胞在急性缺氧環境中的壞死、凋亡，引起心臟電生理、機械活動異常，出現如心力衰竭、心律失常以及心臟破裂等一系列臨床并發癥。所以，急性心肌梗死的治療核心即在缺氧環境中保護心肌細胞免于壞死和凋亡。在細胞和組織中，對低氧環境的適應是通過一系列相關基因的轉錄誘導實現的，這些基因參與了血管生成、鐵代謝、葡萄糖代謝和細胞增殖/存活。而在一系列缺氧適應過程中，缺氧誘導因子-1ɑ（hypoxia-inducible factor-1ɑ，HIF-1ɑ）是關鍵調節因子，負責調控細胞和組織從常氧（～21%O2）到缺氧（～1%O2）的適應和生存［2-3］。HIF-1ɑ是一種對氧敏感的轉錄激活因子，最早是Semenza［3］在1922年發現的。相關研究表明，HIF-1ɑ不僅參與機體對低氧環境的適應調節，同時，在常氧環境下也具有重要的代謝調節作用，并參與胚胎發育過程。近年來，大量臨床及動物研究顯示HIF-1ɑ在動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、心肌保護等方面也發揮了重要作用。在急性心肌梗死患者中，HIF-1ɑ水平與患者預后及再發心血管事件概率呈現相關性，HIF-1ɑ水平較低組預后較差且再發心血管事件概率高［4］。目前，HIF-1ɑ在動脈粥樣硬化、急性心肌梗死及心肌梗死后心肌保護等方面的作用已被廣泛關注，探索其在未來心血管疾病的預防、診斷及治療中的潛在影響已成為當前心血管疾病治療中一大熱點。本文主要就HIF-1ɑ的結構、生物學特性、調控機制以及HIF-1ɑ在動脈粥樣硬化、急性心肌梗死等心血管疾病中的研究進展等方面作一綜述，并進一步探討HIF-1ɑ對未來急性心肌梗死診斷、治療及預后評估方面的潛在價值。

HIF-1ɑ的結構及生物學特性

HIF-1是一種由低氧誘導亞基HIF-1ɑ（分子量為120kD）和一個組成性表達亞基HIF-1β（分子量為91～94 kD）組成的異二聚體復合物。其中ɑ亞單位為HIF-1的活性單位，其轉錄活性受細胞內氧濃度的調控，所以也是HIF-1的調節單位。而β亞單位在細胞中結構性表達，又稱芳香烴受體核轉運蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），可作為芳香烴受體的配體［5］。HIF分子的ɑ亞單位包含1ɑ、2ɑ和3ɑ三個成員，其中HIF-1ɑ目前研究最為完善，并且廣泛表達于各種細胞中。而HIF-2ɑ和HIF-3ɑ的表達則有明顯的組織特異性，如HIF-2ɑ主要在管周成纖維細胞中表達，而成纖維細胞被認為是腎促紅細胞生成素產生的原發部位，故而HIF-2ɑ在慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的研究中關聯較多。根據人類蛋白質圖譜顯示，3種亞型均在心肌組織中有所表達。HIF-1包含堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim，bHLH-PAS）、轉錄激活域（transactivation domains，TAD）和氧依賴性降解域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）3個功能結構域。bHLH和PAS基序是HIF-1ɑ和HIF-1β亞基形成異源二聚體的必需結構，其中bHLH還可與低氧反應元件（hypoxia response element，HRE）結合，啟動下游基因［6］。HIF-2ɑ和HIF-3ɑ也屬于bHLH-PAS超分子家族，在缺氧環境中起穩定作用并能與ARNT結合。在HIF-1異源二聚體中，HIF-1β亞基在組織細胞中結構性表達，其mRNA和蛋白均保持在恒定水平，而HIF-1ɑ的半衰期較短（t1/2，5 min），并受氧濃度的高度調控。事實上，HIF-1ɑ的合成也是連續的，且不受氧濃度的影響。但在常氧環境中，HIF-1ɑ迅速降解，故很難被檢測到且不能發揮其轉錄激活作用。氧含量充足時，HIF-1ɑ在P402和P564的氧依賴降解域被脯氨酸羥化酶（PHD）修飾，羥基化的HIF-ɑ能與VHL腫瘤抑制蛋白結合，并作為E3泛素連接酶復合體的識別元件，通過蛋白酶體途徑迅速被降解并失活，故而在常氧環境中胞質內HIF-1ɑ濃度極低，無法進入胞核并啟動下游一系列目的基因的轉錄。在缺氧情況下，脯氨酸羥化酶活性被抑制，有研究顯示，當氧濃度降低至120μmol/L時，其羥基化HIF-ɑ的能力被明顯抑制［7］。在組織缺氧時，HIF-1ɑ變得穩定，并從胞質中向胞核內轉移，在胞核內與HIF-1β形成二聚體，從而具有了轉錄活性。激活的HIF二聚體隨后與靶基因調控區域的低氧反應元件（hypoxia response elements，HREs）結合，并結合轉錄共激活因子，誘導基因表達。值得注意的是，HIF-1ɑ也可以上調糖酵解酶和葡萄糖轉運蛋白的表達，使細胞更加依賴糖酵解方式供能，提示HIF-1ɑ對細胞能量代謝也有調節作用。在心肌細胞中，絕大多數的HIF靶基因受HIF-1ɑ調控，受HIF-2ɑ調控者少見，而HIF-3ɑ在缺氧環境中的作用尚未明確。故HIF-1ɑ在心血管領域的前景受到廣泛關注。

HIF-1ɑ的調控機制

1、HIF-1ɑ的翻譯后修飾

對HIF-1ɑ的穩定性調控主要由其翻譯后修飾控制，如羥基化、泛素化、乙酰化和磷酸化等過程［8］。關于HIF-1ɑ的修飾發生在多個結構域內。在常氧條件下，HIF-1ɑ氧依賴降解域中的兩個脯氨酸殘基的羥基化和一個賴氨酸殘基的乙酰化可促進其與希佩爾林道腫瘤抑制蛋白（von-Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL）泛 素E3連接酶復合物的相互作用［9-10］。pVHL復合物用泛素標記HIF-1ɑ，泛素化的HIF-1ɑ可被26S蛋白酶體降解。C-TAD是反轉錄激活結構域，位于HIF-1ɑ蛋白的C端半區［11］。C-TAD已被證明可以與CBP/p300等共激活因子相互作用，激活基因轉錄。在HIF-1ɑ轉錄活性的調節中，C-TAD中天門冬酰胺殘基的羥基化可抑制HIF-1ɑ與CBP/p300的相互作用，從而抑制了其轉錄活性。細胞質內合成的HIF-1ɑ被位于ODDD內的脯氨酸402（Pro402）和564（Pro564）上的2-氧戊二酸（2-OG）依賴性雙加氧酶家族快速羥基化［12］。這2個脯氨酸殘基的突變會破壞HIF-1ɑ與pVHL的相互作用，從而在正常氧水平下穩定胞質中的HIF-1ɑ。人類的HIF雙加氧酶是PHD，并且存在3種亞型：PHD1，PHD2和PHD3。可以說，任何影響PHDs的因素都可以影響HIF-1的穩定性及其激活下游目標基因轉錄的能力。PHDs是一種2-OG依賴的雙加氧酶，需要氧（O2）進行羥基化，以及Fe2+和抗壞血酸作為輔助因子。通過2-OG類似物滅活PHDs可以增加HIF-1的半衰期。觀察研究發現，鐵螯合劑及某些金屬離子（如：Co2+，Ni2+，Mn2+）可以降低PHDs活性，穩定HIF-1，這可能是通過減少Fe2+對PHDs的可用性或與Fe2+競爭性結合相應結合位點來實現。同理，抗壞血酸有助于維持鐵在亞鐵（Fe2+）的狀態，對于維持PHDs的活性具有重要意義，可以促進HIF-1ɑ的分解。在常氧環境中，PHDs激活，并使HIF-1的脯氨酸羥基化，促使HIF-1ɑ與pVHL結合并泛素化，最終導致HIF-1ɑ的降解。而在缺氧環境中，PHDs活性被抑制，HIF-1ɑ不能與pVHL結合及完成隨后的泛素化，從而在胞質內積聚，繼而向核內轉移并與HIF-1β結合形成二聚體。由此可見，PHDs的絕對氧依賴性使其可以看作是細胞內的氧感受器。從pVHL角度來看，pVHL與蛋白elongin C、elongin B、cullin-2和Rbx1結合形成VCB-Cul2 E3連接酶復合物，并引起HIF-1ɑ的多聚泛素化，最終使其通過蛋白酶體途徑降解。需要注意的是，pVHL途徑并不是HIF-1ɑ唯一的降解途徑，除了pVHL，許多其他蛋白已被報道影響HIF-1泛素化和穩定性。

2、反式激活域參與HIF-1ɑ的調控

上述HIF-1ɑ的翻譯后修飾過程調節HIF-1ɑ蛋白的穩定性，但單靠穩定性調節并不足以使HIF-1ɑ完全轉錄激活。控制HIF活性的第二個主要機制是通過調節其反式激活域N-TAD和C-TAD。這些結構域通過招募轉錄輔激活子發揮作用，如CBP/p300、SRC-1和TIF2等。在正常氧分壓條件下，FIH-1對HIF-1的C-TAD中的天冬酰胺殘基803（Asn 803）進行羥基化，阻止了HIF-1與CBP/p300的相互作用，從而抑制HIF-1ɑ的轉錄激活功能［13］。缺氧消除了天冬酰胺羥基化，這使得HIF-1ɑ的C-TAD能夠有效與CBP/p300相互作用，激活相應靶基因的轉錄。FIH-1主要位于細胞質中，但也有一部分可能位于細胞核中，而其轉錄活性與氧濃度無關，且不參與HIF-1穩定性的調節。但與PHDs一樣，天冬酰胺基羥化酶FIH-1也是一種2-OG依賴性雙加氧酶，也需要Fe2+和抗壞血酸作為輔助因子，而這種對于氧的依賴性使得FIH-1成為細胞中的另一個氧感受器。

3、HIF-1ɑ的其他調控途徑

盡管羥化酶在感知氧張力和調節HIF-1活性方面具有中心重要性，但還有其他機制參與了HIF-1ɑ功能的調節。眾所周知，磷酸化在蛋白質活性的調節中至關重要，目前，關于HIF-1ɑ的直接磷酸化已被報道，其中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑被廣泛關注。相關研究表明，磷酸化并不影響HIF-1ɑ的穩定性或其與DNA的結合，相反，它增加了HIF-1ɑ的轉錄活性。其中一種可能的解釋是，HIF-1β優先與HIF-1ɑ的磷酸化形式結合。除了氧濃度外，HIF-1ɑ也受某些非氧依賴方式進行調節，其中，細胞因子、生長因子、環境刺激和其他信號分子參與了非缺氧條件下HIF-1ɑ的調控。

HIF-1ɑ的生物學功能

因為HIF-1ɑ最初是在缺氧條件下發現，且主要在缺氧條件下被誘導表達，所以目前大部分關于HIF-1ɑ的研究都涉及缺氧環境。人體細胞和器官均需要適應內環境氧分壓的變化，所以大量HIF-1靶基因是以組織特異性方式進行調節的。約89%的缺氧相關基因的表達共同受HIF-1ɑ的調控，迄今為止，已有100多個具有不同功能的HIF-1ɑ下游基因被鑒定。有研究發現，在動脈內皮細胞中，超過2%的人類基因直接或間接地受到HIF-1ɑ的調控。HIF-1ɑ的低氧適應作用主要體現在紅細胞生成/鐵代謝，血管生成，糖代謝，細胞增殖與凋亡等方面，而其中血管生成作用與心血管疾病關聯緊密，受到廣泛關注。

1、HIF-1ɑ參與血管生成

血管生成是一個復雜的過程，涉及由不同類型細胞表達的多種基因產物。在缺氧環境中，大量參與血管生成不同階段的基因被激活，轉錄增加。其中，血管內皮生長因子（VEGF）作為最重要的內皮特異性有絲分裂原，通過招募內皮細胞進入缺氧和無血管區域，并刺激其增殖而直接參與了血管生成過程。此外，HIF-1ɑ也調節血管張力調控基因的表達，如：一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS2），血紅素氧化酶-1，內皮素1（endothelin 1，ET1）等［14-15］。

2、HIF-1ɑ促進紅細胞生成/鐵代謝

在紅細胞生成和鐵代謝方面，HIF-1ɑ可以上調紅細胞生成和鐵代謝相關基因的表達，從而上調紅細胞運輸氧氣的能力，以適應缺氧環境。其中，HIF-1ɑ調控的促紅細胞生成素（EPO）表達上調起到了重要作用。HIF-1ɑ同時還上調轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體以及銅藍蛋白基因的表達，促進鐵離子的吸收，從而促進血紅蛋白的合成，增加紅細胞的攜氧能力。

3、HIF-1ɑ調節葡萄糖應用途徑及線粒體代謝

在低氧供應條件下，細胞的葡萄糖代謝途徑從氧依賴的三羧酸循環轉向不依賴氧的糖酵解缺氧。由于糖酵解途徑中每個葡萄糖分子中只有2個三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）分子，而不是三糖酸循環提供的38個ATP，缺氧細胞必須通過增加葡萄糖攝取來提高其產生ATP的能力。在缺氧環境中，HIF-1ɑ通過上調糖酵解酶和葡萄糖轉運體的表達來提高細胞對葡萄糖的攝取能力，保證細胞供氧，從而適應低氧環境。同時，HIF-1ɑ還可以抑制線粒體功能，從而降低細胞耗氧量，從另一方面促進細胞的缺氧適應能力。HIF-1ɑ可以通過3種機制調節線粒體的代謝活動。（1）HIF-1ɑ可以抑制丙酮酸脫氫酶激酶-1（pyruvate dehydrogenase kinase-1，PDK-1）的表達，限制丙酮酸進入線粒體，從而抑制線粒體的呼吸作用。（2）HIF-1ɑ可以通過改變細胞色素氧化酶復合物的組成來抑制線粒體呼吸；HIF-1ɑ通過誘導COX4-2和LON的表達，使線粒體呼吸在缺氧環境中效率提高。（3）HIF-1ɑ可以與c-myc聯合作用，誘導HK 2的表達。HK 2是一種糖酵解酶，參與葡萄糖的非線粒體依賴代謝途徑，并具有抗氧化作用。另有研究表示，在缺氧條件下，HIF-1ɑ還可通過絲裂原活化蛋白激酶依賴性途徑被誘導表達并活化，引導缺氧條件下的細胞增殖率增加［16］，從另一角度調節組織對缺氧的適應過程。近期研究發現，HIF-1ɑ也可以在常氧環境下被生長因子、某些糖皮質激素和一氧化氮等誘導表達，但其所涉及的信號轉導通路尚未明確。

4、HIF-1ɑ在胚胎發育中的調節作用

胚胎發育方面，在小鼠動物實驗中發現，敲除HIF-1ɑ基因的小鼠出現心血管發育畸形以及妊娠中期的胚胎死亡［17］，提示HIF-1ɑ在胚胎心血管系統發育中起重要作用。另有研究發現間充質細胞的存活也需要HIF-1ɑ的參與，同之前實驗結果一致，敲除HIF-1ɑ基因的小鼠會出現心血管系統及畸形和神經管缺陷，并于妊娠中期死亡。而雜合子基因小鼠（HIF-1ɑ+/-）可表現為發育正常，但是在慢性缺氧環境中表現出對缺氧的適應能力受損。

HIF-1與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是一種進行性動脈疾病，與急性心肌梗死聯系緊密，不穩定硬化斑塊破裂繼發冠狀動脈內血栓形成是急性心肌梗死的主要原因。動脈粥樣硬化是由血管內皮細胞的損傷引起的，其特點是內膜中有低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）浸潤。隨后進入血管壁的單核細胞分化為巨噬細胞，攝取浸潤的LDL后變為泡沫細胞，最終形成由纖維冒和脂質核心組成的粥樣硬化斑塊。巨噬細胞的進一步激活、細胞凋亡和活性氧的產生均可導致炎性反應，增加壞死核心含量并使纖維冒變薄，進一步促使動脈粥樣硬化斑塊進展。斑塊內出血被認為是斑塊進展和破裂的主要原因，是由于新形成的缺乏內皮完整性的微血管中的紅細胞外滲所致。內皮細胞的完整性受到許多因素的影響，包括炎癥介質、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、VEGF和 促 血 管 生 成 素（Ang）-2與Ang-1的比值，其中一些重要因子的轉錄受HIF-1ɑ調控。HIF-1ɑ在缺血、缺氧和炎癥條件的廣泛生理反應過程中被激活，并在器官或組織對損傷的應激反應中發揮積極作用。目前，HIF-1ɑ在動脈粥樣硬化發生中的作用存在一定爭議。有研究發現粥樣硬化斑塊中的HIF-1ɑ表達上升，且與炎性反應、斑塊表型有關；但另有研究顯示在穩定型心絞痛及不穩定型心絞痛患者斑塊中HIF-1ɑ的表達并沒有顯著差別［18］。有學者認為HIF-1ɑ參與動脈粥樣硬化發生的主要途徑之一是在斑塊內血管生成中發揮作用。來自動脈粥樣硬化斑塊臨床研究的證據表明，HIF-1ɑ在斑塊內巨噬細胞和平滑肌細胞中表達，與VEGF共定位，并與血管生成密切相關［19-21］。這些血管允許脂質、炎性細胞和紅細胞進入斑塊，從而通過促進炎性反應和斑塊內出血來促進斑塊的進展［22］。另一方面，從一些體外研究來看，HIF-1ɑ可能在動脈粥樣硬化發生中發揮不同作用。在體外研究中，巨噬細胞的活化、浸潤和遷移均依賴于HIF-1ɑ。巨噬細胞對氧化的低密度脂蛋白的攝取可以誘導HIF-1ɑ積累，同時HIF-1ɑ又可促進泡沫細胞的形成［23］。在高膽固醇血癥的動物模型中，動脈壁HIF-1ɑ水平的升高與MMP-2和MMP-9的上調相關，而這兩種蛋白酶均可參與動脈粥樣硬化斑塊破裂［24］。這些試驗結果提示HIF-1ɑ有促動脈粥樣硬化作用。也有學者提出，細胞凋亡、細胞外基質代謝、炎性反應、血管生成以及脂質代謝等方面的基因也參與了硬化斑塊的形成與進展過程，并均受HIF-1ɑ的調控，但尚未有體內試驗的證據支持這種假設。綜上所述，HIF-1ɑ在動脈粥樣硬化的進展中發揮重要作用，但其具體機制尚未得到最終證實。

HIF-1ɑ在急性心肌梗死中的作用及機制

缺血性心臟病是發達國家的主要死亡原因之一。心肌缺血是由氧和葡萄糖的供需失衡造成的。當觀察冠狀動脈搭橋術中缺血或梗死患者的心室活檢時，HIF-1ɑ及其下游基因的上調是最初的缺氧適應反應之一，并通過包括誘導血管生成在內的多種方式來適應缺氧環境。近年來研究發現，HIF-1ɑ與心血管疾病相關密切，特別是在急性缺血性心臟病中所起的心肌保護作用尤其顯著。試驗證明，HIF-1ɑ與缺血心肌冠狀動脈側支循環的形成有關。臨床研究發現，在至少有一支冠狀動脈閉塞70%且沒有進行血運重建的患者中，HIF-1ɑ的表達與側支循環數量呈正相關［25］。有證據表明冠狀動脈側支的程度與心肌梗死后梗死面積的減少相關［26-28］，HIF-1ɑ可能在心肌梗死后心肌保護方面發揮重要作用。在動物心肌缺血模型中，缺血誘導后心肌內注射HIF-1ɑ/VP16混合質粒可見明顯的血管生成及心肌灌注改善，同時梗死面積明顯減小［29］。同時，試驗證明向梗死模型心臟左心室轉導PHDs小干擾RNA，干擾PHD表達，以此來減少HIF-1ɑ降解，也可明顯縮小心肌梗死面積并保護心室功能［30］。此外，有研究顯示HIF-1ɑ還可能在心肌缺氧預處理內源性通路中起關鍵作用，作為內源性途徑的關鍵因素，HIF-1ɑ可以在用于預處理預期缺血事件的患者。最后，HIF-1ɑ還可能在缺氧環境中調節心肌細胞葡萄糖的利用方式，保證心肌細胞缺氧環境中的能量供應，從而加強心肌細胞的缺氧適應能力。綜上所述，這些結果表明，心肌梗死后HIF-1ɑ的表達上調可為最大化保護心肌及左心室功能提供一種新的潛在治療選擇。

HIF-1ɑ在急性心肌梗死早期診斷中的應用

隨著生活環境和生活習慣的改變，急性心肌梗死發病率逐年上升，且發病年齡呈現年輕化趨勢。目前臨床主要的心肌壞死標志物有肌紅蛋白、肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等。我們的前期研究發現，急性心肌梗死早期HIF-1ɑ表達明顯升高，且有較好的敏感性及特異性。因此我們認為，HIF-1ɑ可作為急性心肌梗死的炎癥預測因子［31］，與肌鈣蛋白、CK-MB等心肌損傷標志物聯合診斷早期急性心肌梗死。

總結與展望

本文就HIF-1ɑ的功能、調控機制及其在動脈粥樣硬化以及急性心肌梗死中的作用做一綜述。HIF為異源二聚體，包含ɑ和β兩個亞單位，其中HIF-1ɑ為其活性單位，也是其調節單位。HIF-1ɑ在組織細胞對缺氧環境的耐受、胚胎心血管系統發育、動脈粥樣硬化及急性心肌梗死等一系列生理病理過程中起關鍵作用。隨著HIF-1ɑ在生理適應及心肌保護中的作用越發明顯，關于HIF-1ɑ在心血管領域的研究越來越受重視，為其參與臨床急性心肌梗死治療提供了大量經驗與資料。另外，在急性心肌梗死的早期的診斷中，我們的前期研究證明急性心肌梗死時HIF-1ɑ表達明顯上調，同時具有良好的敏感性和特異性，可能作為新的心肌損傷標志物聯合肌紅蛋白、肌鈣蛋白、CK-MB等傳統心肌標志物輔助臨床心肌梗死患者的早期診斷。但HIF-1ɑ表達水平的高低是否與心肌梗死范圍具有相關性仍有待于進一步試驗與研究。隨著新的研究結果的不斷出現，相信HIF-1ɑ將在動脈粥樣硬化以及急性心肌梗死治療策略的制定中發揮重要的作用。