飲料中人工色素定性定量檢測方法的研究進展

陳婭妮，蔡沖，尚袁媛，丁永合，祝迎萱，劉朝俊

中國計量大學生命科學學院（杭州 310018）

人工色素的使用越來越常態化，可以說現在食品工業的發展離不開人工色素的出現與應用。人們最早使用天然色素，后來人工色素的出現克服天然色素提取純化復雜、量少且成本高等特點，被廣泛應用于生產中。生產者按照GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]添加人工色素是合法的，然而部分生產者出于追求更加低廉的成本或使食物色澤更加誘人的目的，在食品生產中添加一些非法人工色素如蘇丹紅、玫瑰紅B等，過量添加人工色素，這會對消費者身體健康造成損傷。因而定性定量檢測產品中所添加的人工色素在市場監督中尤為重要，檢測方法被科學研究者發明并加以應用，針對檢測食用色素的各種方法做出分類分析，以期為人工色素的定性定量檢測研究和市場對飲料中人工色素的定性定量檢測提供理論依據。

為改觀食品的色澤，使之誘人，食品制作過程中往往會加入一種食品添加劑——食用色素。食用色素分為天然色素和人工合成色素。天然色素因來源于植物，往往成本較高，且不太穩定，穩定性和著色度等不如人工合成色素[2]。人工合成色素又稱焦油色素，來源于化工產品，如苯、萘等煤焦油，與天然色素相比，人工合成色素穩定性、著色度強且價格低廉，被廣泛應用于飲料、糕點等食品行業中[3]。國家對食用色素的最大添加限量做出一系列規定，但仍有部分商家非法添加過量的人工色素，使食品從外觀和口味上更加誘人。過量攝入人工食用色素，會對人體健康造成極大危害，如影響兒童的神經系統、智力生長、正常代謝，引起其行為異常；對成人造成生育能力下降，產生的胎兒畸形；長期食用甚至易致癌[4]。因此，對食用色素的檢測開展較多研究。

目前人工色素的定性定量檢測的方法有色譜法、電化學分析法、光譜法等，色譜法的應用最為廣泛，可以同時檢測出多種人工色素，靈敏度高但操作較復雜，且對實驗設備要求較高。光譜法和電化學分析法有其獨特優勢，檢測速度快，操作簡便，但目前的應用較少，且適用于分析成分較為簡單的對象。

1 色譜法

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法亦稱高速液相色譜法、現代液相色譜法等，是色譜法的一個分支，其具有分離效率高、檢測靈敏度高、分析速度快和選擇性好等特點，被廣泛應用于飲料中人工合成色素的檢測。劉亞梅等[5]采用高效液相色譜法，用以快速處理并檢測飲料、泡菜中赤蘚紅含量。結果顯示，赤蘚紅濃度在4～40 μg/mL之間呈線性關系，相關系數為0.999 9，且回收率高、重現性好、檢出限較低。

丘福保等[6]用自制的聚酰胺粉柱對7種人工合成色素檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍的混合樣品富集和凈化后進行高效液相檢測分析，該方法適用于多種人工色素混合樣品的同時檢測。將高效液相色譜法與其他方法聯用，亦可產生較好效果。郭占魁[7]建立一種采用固相萃取結合高效液相色譜法的方法，可同時測定飲料中9種人工合成色素。李幫銳等[8]采用高效液相色譜與質譜聯用法測定飲料中的8種人工合成色素。王雪蓮等[9]應用高效液相色譜-串聯質譜的檢測方法同時檢測赤蘚紅、誘惑紅、檸檬黃、亮藍、靛藍、胭脂紅、莧菜紅、日落黃、新紅這9種人工合成色素。檢測準確度、精確度、靈敏度較高，重現性好，回收率高，其中高效液相色譜和質譜聯用，可消除復雜基質的干擾，能夠對多種組分進行準確檢測。

然而，采用高效液相色譜法進行色素的檢測，前處理較復雜，需要多種大型儀器、多種試劑，對實驗室要求較高，應用于現場的快速檢測有一定的困難。高效液相色譜法具有高壓、高速率、高效率、高靈敏度等特點，被廣泛應用于衛生檢驗、環境保護、生命科學、農業、林業、水產科學和石油化工等領域，尤其適用于分離、分析不易揮發，熱穩定性差和各種離子型化合物。對于部分有機化合物，包括永久性氣體，易揮發、低沸點及中等相對分子質量的化合物則不適用高效液相色譜法進行分析。因此，對于易揮發和相對分子質量較大的人工合成色素，則不宜使用高效液相色譜法，且該方法使用多種溶劑作為流動相，成本高，易于引發環境污染[10]。

1.2 氣相色譜法

氣相色譜法是以氣體為流動相的色譜分析方法，其具有選擇性高、靈敏度高、分析速度快和分離效能高等特點，被廣泛應用于沸點較低和熱穩定化合物的分離與鑒定。焦糖色素是一種黑褐色的廣泛使用的人工合成色素，占整個食品著色劑使用量的90%以上[11]。在以氨（銨）法生產焦糖色素的過程中，由于反應過程中的副反應，可能會產生一定量的有毒物質2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[12]。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的檢測可通過氣相色譜實現。

彭向前等[12]采用頂空進樣毛細管氣相色譜法同時測定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量，測得2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的線性范圍分別為0.012 5～0.150 μg/mL和0.025～0.295 μg/mL，最低檢測濃度分別為0.001和0.002 μg/mL，回收率高，重現性好。亦可將氣相色譜法與其他方法聯用，以求更好的效果。林曉珊等[13]通過氣相色譜-串聯質譜法測定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的含量。王愛軍[14]采用氣相色譜串聯三重四極桿質譜的方法測定焦糖色素中4-甲基咪唑。喬青青等[11]建立采用氣相色譜-正化學源質譜法同時檢測焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法。試驗表明，結果均可觀，操作較為簡單，滿足快速檢測分析的需求，可用于對焦糖色素的質量控制。

氣相色譜法用于分析低相對分子質量、低沸點的有機化合物、永久性氣體等，是石油、化工、環境、醫藥、食品等領域不可或缺的工具。然而氣相色譜要求試樣汽化，不適用于大部分沸點高和熱不穩定的化合物，僅有15%～20%的有機物能用氣相色譜法進行分析。此外，氣相色譜法對于條件的設置較為嚴苛，在進行定性和定量分析時，往往需要純樣或已知濃度的標準試樣，而有些標樣價格昂貴或獲得比較困難[10,15]。

1.3 薄層色譜

薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）可分為常規的薄層色譜方法和高效薄層色譜，分離的選擇性主要取決于固定相的化學組成及其表面的化學性質[16]。TLC是一種快速、簡便、高效、經濟、應用廣泛的色譜分析方法，薄層色譜可單獨使用，也常與傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜、核磁共振、質譜等聯用。

張蘭天等[17]利用高效薄層色譜技術建立檢測飲料中26種人工色素的快速定性和定量分析方法，26種人工色素的回收率在82%～103%之間，SRSD在0.9%～12.7%之間。

相較于前面幾種方法，其更加簡單可靠和靈活高效，適用于現場快速檢測，不過高效薄層色譜（HPTLC）技術在分離能力和檢測靈敏度上仍存在一定的差距。但依然不妨礙其成為輕簡食品分析技術的一個重要發展方向。

1.4 超臨界流體色譜

超臨界流體技術（supercritical fluid chromatography，SFC）以超臨界流體作為流動相，依靠流動相的溶劑化能力進行分離、分析的色譜過程。因SFC既可分析氣相色譜不適應的高沸點、低揮發性的樣品，又比高效液相色譜有更快的分析速度和條件，而兼具氣相色譜和液相色譜的特點。SFC主要應用于小極性化合物，如農藥殘留、脂類維生素類的分析，在人工色素分析中應用較少，多與其他分析技術聯用如質譜，但具有一定的應用前景。

宋镠[18]利用SFC建立同時測定奶油黃、日落黃、檸檬黃、萘酚黃S、固黃、麗春紅3R、柑橘紅2號、胭脂紅、食用綠S這9種人工合成色素的SFC-DAD方法，系統優化影響分離效能的因素，包括固定相、添加劑、溫度、出口壓力，并對市售2種碳酸飲料（美年達、芬達）中的人工色素進行檢測，可以檢測到日落黃，且均小于0.1 g/kg。唐廣云[19]以SFC-MS技術為基礎建立可同時分析金銀花、山銀花中的11種極性化合物的分析方法。SFC的分離能力受較多因素影響，但相較于液相色譜，因其快速、高效、低溶劑消耗的特點而越來越受到重視。

2 電化學分析方法

2.1 示波極譜法

示波極譜法是一種快速加入電解電壓，幾秒內得出一個極譜圖的電化學分析方法，多應用于微量金屬元素、化學物質的快速檢測。

文君等[20]通過液-液分配法從飲料、配制酒類，硬糖、蜜餞類，淀粉、軟糖類中提取人工合成色素赤蘚紅，并用示波極譜法進行測定，檢出限為0.018 62 μg/mL。張麗萍等[21]用示波極譜法檢測飲料中的人工合成色素檸檬黃，并對底液的成分選擇開展試驗，從而提高示波極譜法檢測色素的靈敏度和選擇性。劉紅等[22]用單掃描示波極譜法檢測汽水中混合色素檸檬黃、莧菜紅和胭脂紅的含量，相關系數、回收率均較高。

示波極譜法檢測較快速，但底液種類、用量、酸度的選擇較復雜，且對于含色素產品的檢測從目前研究上看僅限于成分較為簡單的飲料。

2.2 毛細管電泳法

毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）又稱高效毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術，實際上包含電泳、色譜及其交叉內容，能夠分析到小分子水平。

相關研究[23-29]建立毛細管電泳法檢測飲料中的人工色素。云凱[23]建立同時測定飲料中亮藍、莧菜紅、新胭脂紅、檸檬黃及日落黃5種人工合成色素的毛細管電泳-紫外檢測分析方法。王立衛[30]建立高效毛細管電泳法直接測定葡萄酒中莧菜紅及亮藍的方法。

毛細管電泳法可達到對多種人工色素的同時檢測，且幾十分鐘即可完成，簡單快速且結果可靠。毛細管電泳法與其他分離技術結合的方法也應用于人工色素的檢測。常云霞[31]建立負極高壓下場放大樣品進樣（field-amplified sample injection，FASI）結合毛細管電泳（CE）富集分離分析5種人工合成色素（日落黃、新紅、偶氮玉紅、檸檬黃、莧菜紅）的試驗方法，成功地被應用于實際樣品-果凍的分析。胡江濤等[32]采用固相萃取-高效毛細管電泳法測定食品和飲料中9種禁用磺酸類偶氮色素（間胺黃、酸性嫩黃G、二甲基黃、酸性橙I、酸性橙II、酸性品紅6B、麗春紅2R、麗春紅3R、麗春紅SX）。

CE技術的分離效率高、試驗經濟成本低、儀器操作簡易、分析方法模式多種，但該方法不適用于海鹽濃度基質，目標成分痕量但復雜的分析。

3 光譜法

3.1 分光光度法

分光光度法測定色素含量雖然操作簡便、快速，但對于混合色素，產生的吸收光譜往往重疊嚴重，肉眼難以區別分離，需要借助一些化學計量方法進行同時測定。

王志有等[33]運用分光光度計檢測檸檬黃、日落紅、胭脂紅的標準溶液，并借助人工神經網絡（人工神經網絡的研究類似于大腦的人工神經網絡，通過對連續的和間斷的輸入作為狀態反饋而完成信息處理工作，而人工神經網絡算法以TURBO-O語言和編程手段，進行定量檢測各組分的含量[34]）對光譜與濃度關系進行訓練，可同時測定這3種色素的含量，測定市售某橙汁飲料，3種色素的回收率均達到99%左右，神經網絡與最小偏二乘法比較結果均較好。孫延春等[35]對2種吸收光譜重疊嚴重的色素檸檬黃和胭脂紅進行紫外分光光度法測定，聯立方程組對檸檬黃和胭脂紅進行定量分析，測得結果相對偏差小于3%。郭光美等[36]用分光光度法同時檢測5種人工色素喹啉黃、誘惑紅、赤蘚紅、淡紅、靛藍，借助最小偏二乘法建立校正模型，檢出限較低，對微量色素能達到較好的檢出效果。趙麗[37]基于最小偏二乘法，對立春紅2R、日落黃、喹啉黃、堿性橙、酸性綠、直接綠這6種人工色素進行分光光度計測定與分析，檢出限均低于3 μg/mL。

分光光度法可以直接檢測多組分混合而不經分離的人工色素，檢測速度較快，但檢測的產品大多是色素水溶液或成分較為簡單的飲料、果汁，對于復雜成分的產品中色素的檢測應用較少。

3.2 熒光光譜法

熒光光譜是物質受光照射價電子被激發后，能級發生躍遷，電子又從激發態回到基態過程中所發射出的熒光為次級光。熒光光譜法具有高靈敏度和高選擇性的特點，在分析檢測中有著廣泛應用[37]。

陳國慶等[38]發現胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃、日落黃、亮藍5種常用合成食品色素在紫外光激勵下均能產生較強的熒光，且測得的熒光光譜特征明確，光譜特性與其分子結構特點對應，可以將熒光光譜分析技術應用于合成食品色素檢測。孫紅等[39]采用熒光分光光度法建立飲料中的合成色素胭脂紅測定的新方法，胭脂紅的熒光強度與濃度呈良好的線性關系，相關系數達0.994，加標回收率在94.4%～109.2%之間。胡楊俊等[40]采用熒光光譜技術與光譜模式識別方法相結合，將各類食品添加劑視為天然橙汁成分的熒光干擾物質，實現橙汁與橙汁飲料的有效鑒別。胡揚俊[41]用熒光光譜儀對市售碳酸飲料中的6種人工合成色素檸檬黃、日落黃、胭脂紅、赤蘚紅、莧菜紅、亮藍進行三維熒光光譜的測定。

通過BP神經網絡與熒光光譜結合，王俊等[42]實現對日落黃高效、痕量的檢測。出于轉換納米晶與莧菜紅色素溶液存在能量傳遞關系，曹疆艷[43]利用轉換納米晶發光強度作為熒光探針檢測莧菜紅色素溶液，并將制備的NaGbF4：Yb3+，Er3+@NaYF4納米晶做成固態傳感器，可用于反復檢測色素含量。

但是，大多數合成色素不具有熒光特性，不能直接檢測，需要構建熒光體系或借助熒光探針的方法實現定性定量測定。周尚等[44]基于蘇丹紅與硫酸高鈰反應導致其熒光增強，采用熒光光譜法測定食品中蘇丹紅的含量。

熒光光譜檢測具有速度快、靈敏度高的特點，但熒光光譜存在一定的內濾效應，且物質的熒光特性會受到內在結構和外在因素的影響，當溶劑背景存在較強熒光時，對被測物干擾較大，需要進行一定的分離。相較于拉曼光譜和液相色譜等技術，熒光光譜法的簡便性、操作性受到局限。

3.3 近紅外光譜法

近紅外光譜技術具有快速、靈敏度高、操作簡單、分析試樣的狀態不受限制、不破壞樣品等特點，在食品行業上應用廣泛。市面上各種飲品顏色多樣，存在不少違規添加過量人工色素、摻假的現象，對消費者的身體健康造成潛在的危害，因此飲品中人工色素的快速、無損檢測意義重大。

田晶等[45]采用近紅外光譜技術結合統計數學處理方法構建飲料中食用合成色素的預測模型，研究發現修正的最小二乘法結合標準正態變量交換且去散射處理的光譜預處理手段建立的修正的最小二乘法模型，其預測相關系數達0.991，能較為精確地進行飲料中食用合成色素的快速無損檢測。張曉偉等[46]采用近紅外光譜技術結合化學計量學方法構建紅曲米中紅曲橙色素、紅曲紅色素、紅曲黃色素的預測模型，結果表明近紅外光譜技術可用于紅曲色素的快速無損測定，為紅曲米質量的智能化控制提供新途徑。楊昌彪等[47]建立紅酒中非法食品添加劑莧菜紅的近紅外光譜定性分析模型和表面增強拉曼光譜技術快速定性檢測的分析方法。兩方法相互結合，實現快檢中交叉驗證，結果準確可靠，為現場鑒別紅酒是否添加莧菜紅色素提供一個快速可靠的檢測方法。

但是，近紅外光譜技術在低含量的定量分析方法中也不是很成熟，在食品添加劑定量分析研究也較少，因此近紅外光譜檢測食品添加劑的技術還需要進一步完善。飲料樣品屬于液體，對近紅外光譜區域而言，液體中水是一種極強的吸收體，它掩蓋了其他成分吸收近紅外光譜的信號。因此既要獲得較強的待測成分的近紅外信號，又要降低檢測誤差，這是近紅外光譜技術應用在飲料中需要解決的又一問題[48]。

3.4 拉曼散射光譜法

拉曼光譜是一種散射光譜，最早由印度物理學家錢德·拉塞卡拉·文卡塔·拉曼（Chandrasekhara Venkataraman）發現。當一束單色光照射一個透明樣品的時候，絕大部分入射光穿透樣品，極少數發生散射；當散射光與入射光頻率基本相同時，這種散射現象稱為雷利散射（Rayleigh scattering）；當散射光部分用于樣品分子的頻率振動而使少量散射光與入射光頻率不同的散射稱為拉曼散射[49]。樣品的種類不同，所產生的拉曼散射的波長也不同，所以拉曼光譜被認為是確定和鑒別分子種類的方法之一。

葛炯等[50]利用拉曼結合最小偏二乘法較準確地建立煙草中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量與拉曼散射光譜之間的定量模型，且建立的PLS模型可以可靠地預測煙草中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量，檢出限為20 μg/g。可見，普通拉曼散射光譜雖然操作簡便、快速，但在定量檢測方面難以做到痕量。

對于人工色素的微量檢測分析，表面增強拉曼光譜得到探索應用。表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）起始于吸附在粗糙銀電極表面的吡啶分子的拉曼散射比吸附在普通電極上的增強6個數量級，從而在檢測微量物質的可行性體現出來。

陳宏炬等[51]用納米金溶膠作為基底，SERS快速檢測西瓜汁、不同飲料中的合成色素赤蘚紅，檢出限達0.05 mg/kg。林爽等[52]在用表面增強拉曼光譜技術對飲料中3種色素羅丹明B、日落黃和柯衣定檢測時，制備出簡便、價格低的表面增強拉曼光譜濾紙基底，簡便了拉曼基底增強的過程，對于色素的現場快速檢測具有較大的應用前景。王樂等[53]建立基于電化學方法獲得的多孔銀絲基底的快速檢測飲料中人工合成色素玫瑰紅B的分析方法，且飲料樣品無需進行前處理。邵勇等[54]基于SERS技術建立碳酸飲料和功能性飲料中堿性嫩黃O的現場快速定性、定量檢測方法。陳啟振等[55]用金納米溶膠作為增強助劑對6種食品中常添加的色素亮藍、胭脂紅、日落黃、檸檬黃、莧菜紅、誘惑紅進行拉曼散射光譜檢測，樣品前處理和檢測總時間較短，不超過15 min，且檢出濃度在1 ml/L。周世陽等[56]借助增強劑用表面增強拉曼光譜法檢測柑橘紅2號色素，建立QuEChERS前處理技術與表面增強拉曼光譜結合的分析方法，檢出限為1.5 mg/kg。

相較于高效液相等其他檢測方法，拉曼光譜檢測技術具有前處理簡單、操作簡便、檢測時間短、無損等特點，同時便攜式表面增強拉曼光譜儀為色素的現場快速檢測提供較大的便利。

拉曼光譜與其他分離技術聯用的檢測方式可以克服拉曼檢測在復雜的食品基質中易受到樣品中其他組分干擾的問題，從而實現高選擇性地識別檢測目標分析物，如PC-SERS、MIHs-SERS、TLC-SERS等。宋雨琪[57]構建簡單制作、成本低廉、便于攜帶的PEI@PC-SERS基底，用于碳酸飲料中電負性色素檸檬黃、日落黃和胭脂紅的分離和檢測。相較于傳統的SERS基底，該基底克服硬質基底只適用于平面檢測的缺點，便于攜帶用于現場檢測。結合紙色譜的分離能力，PC-SERS不僅可以排除實際樣品中雜質的干擾，更純化了目標色素，提高檢測的靈敏度。徐凱云[58]基于MIHs結合SERS技術，合成包含帶正電荷納米顆粒的具有高選擇性和高靈敏度的新紅分子印跡水凝膠用于新紅的快速檢測，適用于低成本的戶外現場快速檢測，多應用于食品中偶氮類染料。薄夢陽[59]建立TLC與SERS聯用快速檢測食品中的人工色素日落黃、檸檬黃和胭脂紅的方法，且對正山小種、金駿眉、鳳牌紅茶、滇紅工夫4種茶葉樣品進行定性檢測分析。該方法只需進行簡單的前處理即實現實時快速定性和定量檢測，但無法進行精確的定量分析。余慧等[60]以整體柱為基底的SERS法快速檢測和表征混合色素和加標茶飲料樣品中的柯衣定。

4 結語與展望

綜上所述，文章總結了常見色素的定性定量檢測方法，包括色譜法（高效液相色譜法、高效氣相色譜法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法）、電化學分析方法（示波極譜法、毛細管電泳）和光譜法（分光光度法、熒光光譜法、近紅外光譜法、表面增強拉曼光譜法）等檢測方法，每種方法各有優勢。從時間進程上看，色素檢測由傳統的色譜技術、電化學分析向光譜的方向發展，在準確的同時追求快速、高效，從而為市場檢測提供基礎。

食品工業化的發展離不開添加劑的使用，起著色功能的人工色素在飲料、糕點等食品中使用頗多，生產者過量或使用非法人工色素將威脅消費者的身體健康，造成巨大的社會問題。市場監督人員對市面上的食品進行色素檢測的同時，快速、高效、簡便、微量準確的方法正是所需。光譜檢測的研究近來為這種需求提供可能。