動(dòng)物病毒分離培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

吳通奎，包濤濤，黃功明，汪忠榮，莫興虎

黔東南州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州凱里 556000

眾所周知，病毒是一種缺乏完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)及獨(dú)立完整酶系統(tǒng)的特殊結(jié)構(gòu)，這也使得病毒不能在沒有生命的培養(yǎng)基中單獨(dú)生長，僅能依靠在活的組織細(xì)胞內(nèi)生長繁殖。動(dòng)物試驗(yàn)，雞胚接種與細(xì)胞培養(yǎng)是3 種較為傳統(tǒng)且經(jīng)典常用的病毒分離方法。研究者通過以上方法分離出了很多不同種類的病毒，當(dāng)然也從不同方面分別對病毒的生長周期，宿主的免疫應(yīng)答等做了前期試驗(yàn)研究，為當(dāng)代病毒學(xué)的科學(xué)研究打下了前期基礎(chǔ)。但隨著病毒變異頻繁性、新發(fā)病毒的突發(fā)性及一些較難培養(yǎng)病毒的特殊性，使我們在研究領(lǐng)域遇到了很多疑難雜癥，這也導(dǎo)致我們在病毒的深入研究中受到了一定的限制。本文分別從病毒傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)及近年來探索發(fā)現(xiàn)的一些新技術(shù)做一論述，旨在為病毒的深入研究提供一定參考依據(jù)。

1 傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)技術(shù)

1.1 動(dòng)物試驗(yàn)

動(dòng)物試驗(yàn)是在病毒分離培養(yǎng)中的一種較為常用且經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法，通過使用這種方法一方面可以適用于大多病毒的分離培養(yǎng)和測定動(dòng)物敏感范圍，另一方面還能將其用于鑒定病毒和分析不同毒株之間的抗原關(guān)系等。除了以上用途外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還能用于病毒的保存和弱毒株的復(fù)壯，及生產(chǎn)大量的動(dòng)物組織疫苗等。同種及異種動(dòng)物是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所必要的兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物類型，對于同種動(dòng)物來說，我們在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先進(jìn)行血清學(xué)檢查，經(jīng)抗體檢測合格后方能使用，以確保所選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是合格的。小白鼠、大鼠及個(gè)體較小的豬只等是我們實(shí)驗(yàn)過程通常選擇的異種動(dòng)物類型。在我們選擇動(dòng)物開展試驗(yàn)時(shí)，要盡可能保證動(dòng)物是健康的且品種是純凈的。根據(jù)病毒的特性不同，優(yōu)先選用敏感性高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，盡量采取不同的接種方式進(jìn)行接種。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中還需考慮多做幾個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以便增加試驗(yàn)數(shù)據(jù)的說服力。同時(shí)必須嚴(yán)格設(shè)立對照組，盡量避免因動(dòng)物的個(gè)體差異而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立。最后，在操作過程的每一環(huán)節(jié)必須保證無菌操作，若無法確定實(shí)驗(yàn)條件是否達(dá)到無菌狀態(tài)，可將青、鏈霉素按要求制作成雙抗混懸液，按一定比例加入至接種液中，再對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。

1.2 雞胚培養(yǎng)

許多病毒尤其是禽源病毒幾乎都能在雞胚中進(jìn)行增殖，利用雞胚可以進(jìn)行病毒分離鑒定、抗原制備及疫苗生產(chǎn)等。除雞胚外，鵝胚和鴨胚也能用于個(gè)別病毒的增殖。通常應(yīng)選擇無病雞群中新鮮、潔凈及受精率較高的（90%以上）SPF 種蛋，以白殼蛋最佳，因其顏色單一且照蛋時(shí)也便于操作者觀察。雞胚孵化器溫度一般控制在37.5 ～38 ℃，濕度控制在60%～65%左右，翻蛋頻率保持在3 次/d 以上。在前期翻蛋時(shí)應(yīng)先將蛋進(jìn)行橫放，在試驗(yàn)接種前2 天再改為豎放，操作過程還要特別注意雞胚位置，以接近蛋盤中間為宜，不要過于偏向一側(cè)。孵化過程還需進(jìn)行專人管理，遇到故障時(shí)及時(shí)維修，避免造成不必要損失。接種前照蛋，應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分出活胚與死胚，活胚血管分支十分明顯呈鮮紅色，胚胎能夠自由移動(dòng)，死胚血管模糊不清或有時(shí)呈暗紅色，我們應(yīng)該選擇活胚進(jìn)行接種。一般選擇9 ～11日齡雞胚用于接種，某些特殊病毒則需根據(jù)其特性而選擇特定日齡雞胚。根據(jù)不同病毒增殖特點(diǎn)可選擇不同接種方式，常見接種方式主要有絨毛尿囊膜接種，尿囊腔接種、羊膜腔及卵黃囊接種等。與此同時(shí)，我們在接種時(shí)還需保證接種環(huán)節(jié)的無菌，如通?？上仍诘皻ど鲜褂玫饩撇潦孟? ～5 次，然后再使用酒精進(jìn)行脫碘操作，接種后的雞胚使用石蠟進(jìn)行封閉針孔。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在病毒研究領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，不僅能用作病毒的分離培養(yǎng)，還能用作病毒繁殖過程及細(xì)胞敏感性的相關(guān)研究。

1.3.1 原代培養(yǎng)

無菌采集動(dòng)物組織并剪碎，先經(jīng)胰酶消化獲得單細(xì)胞懸液，再將其轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。實(shí)踐中雞胚成纖維細(xì)胞、鴨胚成纖維細(xì)胞及犢牛睪丸細(xì)胞等均常用于不同病毒的分離。

1.3.2 二倍體細(xì)胞培養(yǎng)

將原代單層細(xì)胞消化分散為單個(gè)細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)傳代仍為二倍體，這種細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)大，對病毒易感性一般影響不大，從樣本中分離培養(yǎng)病毒，通常使用這種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 傳代細(xì)胞培養(yǎng)

在體外培養(yǎng)液中可無限制分裂傳代的細(xì)胞，一般來源于腫瘤組織。研究者們已成功建立了多種傳代細(xì)胞系，如非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、猴腎上皮樣細(xì)胞(Mark-145)、豬睪丸細(xì)胞(ST)及豬腎細(xì)胞 (PK-15)等細(xì)胞系。傳代細(xì)胞培養(yǎng)較為方便且使用也較為廣泛，但其也有弊端，如對某些病毒不敏感，傳代時(shí)間長及易被支原體污染或病毒隱性感染，也存在致腫瘤的潛在危險(xiǎn)。傳統(tǒng)細(xì)胞病毒分離方法固然有效，但是耗時(shí)長、效率低及易污染這是不可否認(rèn)的。近幾年，隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了很多細(xì)胞培養(yǎng)的改良方法，如離心培養(yǎng)、混合培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)等試驗(yàn)技術(shù)，這些技術(shù)使得病毒分離培養(yǎng)在時(shí)間及效率上得到了極大程度的改善。

2 病毒分離培養(yǎng)新技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 “木筏式”培養(yǎng)

這種方式是一種將上皮細(xì)胞置于“氣－液”兩相介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)，就猶如木筏在空氣和水面之間，故又形象地將這種培養(yǎng)方式稱為“木筏式”培養(yǎng)。該方式可以使細(xì)胞高效生長并快速分化，對于接近自然狀態(tài)下宿主組織的原代呼吸道上皮細(xì)胞就是一種培養(yǎng)模型，研究者們正是利用它能模擬出呼吸道生理環(huán)境的這種獨(dú)有特點(diǎn)，才建立起了各種呼吸道病毒的復(fù)制及其病理機(jī)制的多種研究模型。

2.2 基質(zhì)培養(yǎng)模型

3D 基質(zhì)培養(yǎng)模型，是一種既能支持細(xì)胞的復(fù)制分化，又能為細(xì)胞模擬出體內(nèi)生存微環(huán)境的培養(yǎng)體系。近年來關(guān)于基質(zhì)培養(yǎng)模型的報(bào)道不斷增加，其中人工基底膜培養(yǎng)體系便是其中一種。人工基底膜是一種膠狀的蛋白混合物，通?？梢詫⑵溆米髦Ъ?，以盡可能地模擬出體內(nèi)復(fù)雜的3D 細(xì)胞外環(huán)境。研究表明，使用這種模型進(jìn)行培養(yǎng)能夠很好地解決自然狀態(tài)下病毒的感染和復(fù)制問題。

2.3 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)模型

旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器（RWVB），一種最初由美國人設(shè)計(jì)并用于模擬太空微重力的特殊設(shè)備，具有可以精確模擬機(jī)體組織的內(nèi)部環(huán)境特點(diǎn)。研究者們正是利用RWVB 的這種優(yōu)勢，將其成功改裝成了一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。該裝置是一種內(nèi)部充滿液體的圓柱體旋轉(zhuǎn)裝置，操作者可以根據(jù)細(xì)胞的種類、特性及培養(yǎng)物的大小對該培養(yǎng)裝置的轉(zhuǎn)速進(jìn)行自動(dòng)調(diào)節(jié)，以確保培養(yǎng)物可以在長時(shí)間內(nèi)保持懸浮的狀態(tài)。使用RWVB 培養(yǎng)的細(xì)胞具有一定空間自由度，這種自由度對細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基質(zhì)之間的接觸也是非常有利的，因?yàn)樗苤噩F(xiàn)細(xì)胞極性，也能模擬出體內(nèi)組織的真實(shí)環(huán)境，這些因素對于病毒與宿主之間的相互作用機(jī)制的研究也是非常重要的。此外，與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方式相比，由RWVB 培養(yǎng)的細(xì)胞對病毒具有更強(qiáng)的抵抗力，同時(shí)其也能產(chǎn)生更多的感染性病毒顆粒，病毒顆粒的增加從另一方面也表明使用RWVB 方式培養(yǎng)能夠更好地模擬出體內(nèi)環(huán)境。

2.4 干細(xì)胞來源細(xì)胞培養(yǎng)

對于某些培養(yǎng)較為困難的病毒來說，選擇敏感性高的細(xì)胞做原代細(xì)胞培養(yǎng)通常為首選。然而采用原代細(xì)胞培養(yǎng)也可能會因個(gè)體差異而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同影響，針對這種情況目前尚無成熟可行的評價(jià)體系，同時(shí)其培養(yǎng)方式是一種細(xì)胞在體外環(huán)境中單獨(dú)生長，也存在不能長時(shí)間培養(yǎng)的局限性，這一點(diǎn)也是不容忽視的。當(dāng)前已有很多使用干細(xì)胞來源的培養(yǎng)方式培養(yǎng)分化為相應(yīng)的敏感細(xì)胞并用于病毒培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。總的來說，與其他方法相比，干細(xì)胞來源的細(xì)胞培養(yǎng)在體外培養(yǎng)的時(shí)間可以達(dá)到更長，也能長時(shí)間的維持細(xì)胞的特異性表型，同時(shí)還能高度表達(dá)與病毒感染復(fù)制的相關(guān)因子，對于病毒與宿主之間作用的研究也非常適合。

3 小結(jié)

隨著世界醫(yī)學(xué)水平的快速發(fā)展，用于檢測各種病毒的方法也隨之不斷更新，如分子生物核酸探針檢測技術(shù)和免疫學(xué)方法檢測技術(shù)等。分子生物學(xué)相關(guān)檢測方法，因憑借其操作方便、靈敏度高等優(yōu)勢在疾病檢測中得到了廣泛應(yīng)用。但一直被作為病毒鑒定“金標(biāo)準(zhǔn)”-病毒分離培養(yǎng)法，仍存在靈敏度低、耗時(shí)、耗力等缺點(diǎn)。隨著生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)病毒分離培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)也與時(shí)俱進(jìn)得到了各種新的進(jìn)步，也彌補(bǔ)了之前的短板與不足，同時(shí)也提高了傳統(tǒng)分離方法的實(shí)用性。而后期研究的立體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一方面可以提高病毒分離的效率及靈敏度，另一方面也為一些培養(yǎng)及分離困難的病毒提供了新的研發(fā)思路，這些技術(shù)在病毒分離、感染、病毒與宿主相互作用等方面的研究具有較好的應(yīng)用前景。