SFRP5基因干擾載體的構建及鑒定

鄭 強

黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319

隨著生活結構的調整以及飲食質量的提高，高能食物已成為人類普遍的食物來源。雖然脂肪組織可作為機體重要的能量來源，但脂肪攝入的過多會間接導致機體發病，如重度肥胖、高血壓、脂肪肝、高血脂等疾病，對人類健康造成了巨大的危害。從細胞層面分析，脂肪的積累既包括脂肪細胞數量的增多，又包括脂滴體積的增大。從動物個體水平分析，多個脂肪細胞的增殖和分化必然導致機體肥胖和疾病發生。脂肪組織可分為棕色脂肪組織（BAT)和白色脂肪組織（WAT)。棕色脂肪細胞中分布著許多脂肪滴，其細胞核分布于細胞的中央，含有許多微細的血管，棕色脂肪組織在成年動物中很少發現，僅在特殊情況下出現。然而，幼齡動物和冬眠動物中含量較多，主要存在于哺乳動物的肩胛區、頸后背部和腺體的腋窩下部。此外，有研究發現脂肪組織自身也可以分泌脂肪細胞因子，參與調控動物機體能量代謝和能量平衡。分泌型卷曲相關蛋白5是一種調控脂肪的重要細胞因子，其在機體能量代謝過程中發揮了重要作用，但其具體的調控機制尚不明確。因此，揭示脂肪細胞增殖分化時是否受到SFRP5的調控展開具體研究，對機體肥胖的預防及與肥胖相關疾病的治療奠定基礎[1]。脂肪組織不僅完成了機體大部分能量的存儲，還可以調節體內的生理機能。脂肪組織沉積主要通過脂肪細胞數量增多及脂滴積累兩種形式實現。脂肪細胞增殖與分化受諸多因素影響，Wnt信號通路是較早發現的傳統信號通路，參與脂肪細胞增殖分化的調控。SFRP5具有雙向調節作用，可抑制Wnt信號的轉導，兩者共同作用，共同影響著脂肪細胞的增殖分化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體

從VectorBuilder公司購買SFRP5重組腺病毒干擾載體，載體名稱pAV-shRNA-EGFP（VB161026-1127kyf），pAV-mSFRP5shRNA-EGFP（VB171121-1371tah）。

1.1.2 細胞系

本實驗室保存的HEK293A細胞、3T3-L1細胞均購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3 試驗試劑DMEM培養基、酒精、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液、質粒提取試劑盒。

1.1.4 主要儀器

CO2細胞培養箱、冰箱、酶標儀、液氮罐、水浴鍋、離心機、凝膠成像儀、磁力攪拌器、培養瓶、培養皿（10 mm、60 mm）、多孔培養板（12、48、96孔）、吸管、移液管、移液槍、移液槍頭、顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 SFRP5腺病毒干擾載體的鑒定

將購買的pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRN A-EGFP載體在含卡那霉素的LB固體培養基中培養，挑取單克隆，擴繁后，用質粒提取試劑盒將其中的質粒提取出來。然后通過PacI進行酶切，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定。

1.2.2 病毒制備

將無血清雙抗的培養液（Opti-MEMI）稀釋4 μg質粒，稀釋至250 μL。將Opti-MEMI稀釋10 μL Lipofectamine TM2000稀釋25倍，在室溫下培養25 min。將 Lipofectamine TM2000和質?；旌希@得混合液，室溫培養20 min。將混合液放入CO2培養箱6 h，6孔板需要設置對照組。24 h的轉染后，用熒光顯微鏡下觀察綠色熒光和細胞的病變情況。10 d后將細胞收集，在液氮罐和恒溫水浴鍋中反復凍融5次，離心，分離上清液，用于細胞感染。

1.2.3 病毒擴繁

將HEK293A細胞培養到培養皿面積90%時，腺病毒感染8個培養皿。24 h后，顯微鏡觀察到少許細胞漂浮。再經過24 h，絕大多數細胞漂浮，收取細胞。離心10 min轉速1 200 rpm，棄掉上清液。加入培養液DMEM大約4 mL，反復凍融，三次即可，每次10 min。然后離心5 min轉速2 000 rpm，將離心得到的病毒保存于-80 ℃冰箱中。將293A細胞分裝到20個150 mm的培養皿中，用病毒感染，以獲取更多的293A細胞。48 h,病毒成熟后，PBS清洗，收集細胞，離心10 min轉速1 000 rpm，棄掉上清液，PBS沖洗1～2次，裂解病毒。超低溫冰箱（-8 ℃）保存。

1.2.4 病毒滴度測定

根據病毒的預期滴度，準備8個無菌離心管，加入90 μL無菌培養基，取待測的病毒原液10 μL加入第一個管中，混勻后取10 μL加入第二管中，繼續相同操作，直至最后一管。選取所需的細胞孔，吸去90 μL培養基，丟棄。加入90 μL稀釋好的病毒溶液，培養。24 h后，加入完全培養基100 μL。48 h后，計算滴度。

1.2.5 重組腺病毒感染效率測定

3T3-L1細胞被腺病毒感染后，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，這是被病毒所感染的細胞。將熒光顯微鏡和普通顯微鏡的檢測結果進行對比，求其感染效率。

1.2.6 HEK293A細胞培養

在培養時，取出存儲的細胞，放入恒溫水浴鍋（37 ℃）中，經過1 min，在里面的冰尚未完全融化時取出。取出后，酒精擦拭消毒，將細胞轉移到培養瓶中培養。12 h后，取出細胞，顯微鏡觀察細胞貼壁情況。待細胞覆蓋培養瓶面積的80%左右時，進行消化。棄掉培養基，PBS清洗，加入胰酶吹浮細胞。消化傳代后，儲存備用[2]。

2 結果與分析

2.1 Ad-SFRP5 shRNA腺病毒干擾載體的鑒定

從Vector Builder購買的pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP載體，腺病毒重組載體中包含綠色熒光蛋白EGFP，SFRP5的干擾序列位于其CDS區的1078～1098 bp，插入載體的788～835 bp位置，干擾分值為13.2。對其進行PacI單酶切鑒定發現，Pac1酶切結果顯示pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP載體質粒均釋放一個長度為2081 bp的片段。通過測序及序列比對，發現克隆序列與插入序列完全一致，證明Ad-SFRP5 shRNA載體構建成功。

2.2 干擾載體病毒包裝

通過脂質體共轉染的方法分別將pAV-shRNAEGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP質粒導入HEK293A細胞中。2 d后，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達。6 d后，周圍的細胞逐漸被感染，病毒開始釋放，且感染面積越來越大。10 d后綠色熒光蛋白的面積進一步增加。將收集到的原始病毒繼續感染HEK293A細胞，48 h后90%的地區都已被熒光蛋白覆蓋，表明細胞的形態開始發生變化，開始變大，變圓。

2.3 干擾載體感染3T3-L1細胞系

3T3-L1細胞被病毒感染。48 h后，感染的3T3-L1細胞在熒光顯微鏡下出現綠色熒光，并且80%以上均被感染，證明Ad-SFRP5 shRNA重組腺病毒可感染細胞系。

3 討論與結論

脂肪因子是調節機體功能的重要因子，在機體內有著不可替代作用。脂肪因子的失調會導致肥胖，動脈粥樣化等疾病的發生。肥胖是由于生活方式的轉變和飲食結構的轉變所引起的結果，是由于體內的脂肪細胞增殖分化，引起脂肪組織的沉積。肥胖所引起的相關疾病大多是一些炎癥性的疾病，會抑制某些激素的活性，機體內的一些信號通路會抑制蛋白酶的活性，干擾脂肪細胞的分化，使白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉變。SFRP5基因在維持機體的生命活動方面具有重要的作用，主要在脂肪細胞中表達，在脂肪細胞的增殖分化方面具有重要的誘導作用。同時可以抑制炎癥因子的活性，抑制炎癥因子或使其不表達，改善代謝性疾病，對動脈粥樣化、脂質沉積等疾病的研究產生重要的影響，對疾病的治療具有重要意義[3]。本研究通過Pacl單酶切和測序鑒定，篩選獲得Ad-Scramble shRNA和Ad-SFRP5 shRNA陽性克隆。通過HEK293A細胞包裝、病毒擴繁、腺病毒感染效率測定等，成功取得了所需的病毒顆粒[4]。3T3-L1細胞系被獲取的病毒感染后，發現其感染效率可達80%以上。此次結果表明載體構建及病毒制備成功，為以后的試驗研究打下基礎。