實時熒光定量技術在食品微生物檢測和研究中的應用

王春梅

（山東省東營市廣饒縣疾病預防控制中心，山東廣饒 257300）

實時熒光定量技術作為一種成熟的微生物檢測方法，在實踐應用過程中表現出極強的精準度與靈敏性，是現階段食品安全管理的重要舉措[1]。為更好地發揮其技術優勢，規避實時熒光定量技術的應用誤區，有必要從實踐角度出發，堅持需求導向、目標導向以及結果導向，立足熒光定量技術原理，在總結過往技術應用經驗前提下，立足于食品微生物檢測要求，劃定檢測框架，厘清檢測流程，確保實時熒光定量技術應用的標準化與規范化，切實滿足現階段食品微生物檢測要求，強化食品安全風險管控能力，加速形成良好的市場秩序。

1 實時熒光定量技術概述

本文全面梳理實時熒光定量技術原理以及技術特點，實現技術觀念全面改變，明確技術應用場景，掌握技術應用重點，為實時熒光定量技術在食品微生物檢測中的科學、高效應用提供方向性引導。

1.1 實時熒光定量技術原理

實時熒光定量技術主要通過擴增反應，對每個循環產物中的熒光信號進行檢測，通過對起始模板開展定量以及定性分析，確保檢測數據的有效性與合理性[2]。實時熒光定量技術在熒光化學物質的有效介入下，可以確保反應產物不斷積累，加速檢測進程，縮短檢測周期。在整個反應產物積累過程中，熒光信號強度也出現持續變化，對每輪熒光強度信號開展強度監測，可以快速獲取信號變化規律，在此基礎上，繪制熒光擴增曲線圖，檢測人員可通過熒光擴增曲線開展深入分析，可以在較短時間內，快速完成檢驗分析任務，獲取目的基因初始量，實現對檢測對象的精準識別。實時熒光定量技術在長期實踐過程中，技術類型逐步多元化，通過技術模塊的合理化選擇，滿足不同場景下的食品微生物檢測要求。從技術原理以及應用效果來看，實時熒光定量技術具有技術成熟，操作環節簡單，成本投入較低以及較強可行性的特點。

1.2 實時熒光定量技術優勢

實時熒光定量技術具有反應速度快、靈敏性高、特異性強等優勢，可滿足食品檢測工作的要求，有效兼顧了檢測精準度與實效性要求，通過實時熒光定量技術的合理化應用，可提升食品微生物檢測能力，推動食品安全管理的健全與完善[3]。實時熒光定量技術從本質上來看，屬于封閉性反應體系，反應條件較為簡單，檢測工作推進過程中，不需要電泳、染色等步驟，因此檢測流程得以簡化，客觀上縮短了食品微生物檢測周期，提升了檢測效率。同時實時熒光定量技術使用全新的升降溫機制，可靈敏地管控溫度，大大減少了擴增反應周期，將整個檢測周期控制在2 h內。與常規熒光定量技術相比，實時熒光定量技術數據獲取難度較低，增強了檢測數據的可靠性與精準性，為后續食品安全風險評估提供了依據[4]。實時熒光定量技術依托光譜技術與計算機技術，實現了檢測靈敏度的有效提升。在實際應用環節，實時熒光定量技術對于DNA檢測濃度可以到pg級別，最大程度地保證檢測效果，排除干擾因素影響。實時熒光定量技術在微生物檢測過程中，增加了熒光探針，這種檢測方案主要針對于靶序列，可以確保非特異性產物無法與探針進行雜交，有效分離與特異性物質分子量接近的物質，實現特異性精準劃分，確保食品微生物檢測任務的順利完成[5]。基于實時熒光定量技術優勢，越來越多的檢測團隊嘗試轉換思路，著眼檢測要求，采取必要舉措，推動實時熒光定量技術在食品微生物檢測中的科學、高效應用，確保檢測的有效性與精準性。

2 實時熒光定量技術在食品微生物檢測中的應用

實時熒光定量技術在食品微生物檢測中的應用，要求檢測團隊立足于檢測原理，以科學性、實用性原則為框架，采取系列舉措，確保實時熒光定量技術的合理化應用，全面滿足食品微生物檢測要求。

2.1 實時熒光定量技術在食品致病菌檢測中的應用

實時熒光定量技術在食品致病菌檢測過程中，檢測人員需從實踐角度出發，認真做好檢測流程理順、檢測方法優化等系列工作，確保實時熒光定量技術優勢的全面發揮，實現對致病菌的精準識別[6]。考慮實際檢測要求，檢測人員需要合理優化檢測環節，科學做好探針、染色等檢測步驟的優化調整，以更好地提升檢測的有效性。基于實時熒光定量技術特性，為排除擴增效率、試劑損耗等因素影響，在數據計算過程中，檢測人員可以充分利用Q值，借助擴增指數增長情況，確立起始模板，以此為標準，便于開展檢測過程中的數據對比。以金黃色葡萄球菌檢測為例，在使用實時熒光檢測過程中，在做好樣本制備的基礎上，利用技術優勢，技術人員可以采用TaqMan探針和SYBR Green染料兩種方法，快速定量檢測金黃色葡萄球菌，同時對于檢測數據，使用數據處理軟件，開展檢測數據分析，進而獲得黃金葡萄球菌濃度。這種方法對目前已知的29株臨床和食源性金黃色葡萄球菌egc變種菌株、4株egc陰性金黃色葡萄球菌菌株和37株種族近似的相關菌株的檢測特異性都接近100%，在實踐過程中，表現出較強的實用屬性[7]。

2.2 實時熒光定量技術在食品基因檢測中的應用

現階段，為了保證食品微生物檢測的精準度，在實時熒光定量技術應用環節，檢測人員可以有序開展食品基因檢測等工作，通過基因序列識別，提升檢測技術的應用水平[8]。與傳統基因檢測方法相比，實時熒光定量技術實用性與可操作性較強，可快速完成檢測任務，有效滿足現階段食品基因檢測要求，對于食品生產、加工等系列活動開展提供了技術支撐。在轉基因成本定量分析中通常選擇轉基因生物基因組中的外源序列作為目標序列，其中包括啟動子、終止子、目的基因等。根據檢測的外源目標序列的不同分類，轉基因食品在應用實時熒光定量檢測技術進行檢測時，技術人員集中進行通用序列檢測、結構特異性序列檢測、基因特異性序列檢測，通過全方位檢測，判定基因序列，從而順利完成基因檢測任務，快速掌握基因信息。

3 實時熒光定量技術應用注意事項

3.1 科學設定檢測標準

實時熒光定量技術在應用過程中，為確保檢測成效以及檢測結果的精準性，有必要從檢測技術原理出發，定向做好檢測樣本比較工作。基于實時熒光定量技術，在實際檢測環節，應設定實時熒光定量反應指數，預先框定熒光信號域值，當檢測數據超過熒光信號域值時，可以將其認定為真正的檢測信號，在此基礎上，開展數據監測，科學定義樣本預值循環數，從而達到定量分析的目的。根據相關研究，設定的實時熒光信號域值與檢測對象起始拷貝的對數存在較為明顯的線性關系，起始檢測對象拷貝數量越多，域值越小，基于這種內在邏輯聯系，在檢測過程中，可以根據已知的各類數據繪制標準曲線，將其作為評估未知樣品檢測域值的重要依據，實現對未知成分屬性的科學評估[9]。

3.2 實現無誤差的科學處置

實時熒光定量技術在應用過程中，在部分條件下會受到同源DNA、異源DNA、寡核苷酸雜交特異性、探針比例和細胞分解效率等因素的影響，造成定量檢測結果出現偏差，甚至出現假陽性情況[7]。為排除干擾因素的影響，檢測人可借助有效的數據處理，通過數學模型，縮小誤差，確保檢測結果的精準度。檢測人員需通過標準曲線的繪制，借助相關軟件，設置異常數據報警提醒，從而消除數據誤差，提升整個檢測工作的精準度。同時積極探索實時熒光定量技術樣品制備的簡單化、快捷化方式，逐步提升檢測成效，縮短樣本制備周期，推動整個檢測流程的有序開展。

3.3 全面提升數據分析能力

實時熒光定量技術應用過程中會產生大量數據，需要檢測人員根據實際需要開展定性與定量研究，通過數據發掘，排除干擾因素，確定食品中的微生物含量，順利完成食品檢測任務。基于提升數據分析能力的考量，檢測人員可吸收、借鑒以往經驗，利用大數據技術、專業數據處理軟件對實時熒光定量檢測環節產生的擴容數據等開展綜合分析，快速繪制標準曲線，通過檢測數據與標準數據的橫向對比，準確判定檢測結果。同時，開展數據分析能力培訓與提升專項活動，定期組織人員開展系列學習活動，介紹實時熒光定量檢測數據分析新方法、新路徑，逐步提升檢測人員對于檢測結果的分析能力。

4 結語

食品產業發展過程中，為提升安全水平，化解潛在風險，應做好微生物檢測工作，實現食品安全的有效管理。實時熒光定量技術憑借自身優勢，能夠較好地滿足食品微生物的檢測要求，實現食品安全的有效管理，減少公共衛生事件的發生機率。本文著眼于實際，在明確實時熒光定量技術原理以及技術優勢基礎上，梳理技術應用新思路，摸索技術應用新方法，實現實時熒光定量技術的高效化使用，構建現代化食品微生物檢測技術體系。