基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術的二至丸入血入腦成分分析

林雪，薛傲，徐艷明，孫琪，徐紅丹，，薛慧，楊波*，張寧，*（.黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱 50040；.黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 54007）

二至丸由墨旱蓮、女貞子兩味藥組成，具有補益肝腎、滋陰止血的功效。現代藥理學研究表明，二至丸在抗衰老、益智等方面作用顯著[1]，能夠治療阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）[2]，但其發揮藥效的活性成分尚未明確。UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術以其高分辨率、高質量精度的特點，在中藥成分定性定量分析領域具有獨特優勢[3]。藥物轉運到作用部位才能發揮作用，吸收入血尤其入腦的成分可能是二至丸治療AD 的潛在藥效成分。目前對于二至丸入血入腦成分的研究相對較少，基于此，本實驗運用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術對給予二至丸的D-半乳糖（D-gal）模型大鼠的體內成分進行分析，以期闡明二至丸治療AD 的藥效物質基礎。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Dionex UltiMate 3000 戴安高效液相色譜儀，Q-Exactive Focus 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Bionoon-VAC1型真空濃縮儀（上海般諾生物科技有限公司）；Mikro 200R 型離心機（德國 Hettich 公司）。女貞子（酒）、墨旱蓮[北京同仁堂，經黑龍江中醫藥大學陳效忠副教授鑒定符合2020年版《中國藥典》要求]。HPLC 級甲醇（美國Dikma 公司）；HPLC 級乙腈（美國Fisher 公司）；HPLC 級甲酸（美國Tedia 公司）。D-gal（上海吉至生化科技有限公司，批號：D96420，純度99%）。紅景天苷（批號：B20504）、特女貞苷（批號：B21240）、木犀草素（批號：A0108）、蟛蜞菊內酯（批號：B20934）、芹菜素（批號：B20981）、齊墩果酸（批號：BP1026）（上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%）。

1.2 動物

SD 大鼠，雌性，SPF 級，12 只，210～250 g [黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，合格證號SCXK（黑）2018-004]。

2 方法

2.1 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 檢測條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35℃，流速0.3 mL·min－1，進樣量5 μL，流動相為0.1%的甲酸-水（A 相）和0.1%的甲酸-乙腈（B 相），梯度洗脫（0～3.5 min，5%～15%B；3.5～6.5 min，15%～30%B；6.5～12.5 min，30%～70%B；12.5～18 min，70%～100%B）。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），采用正、負離子檢測模式；掃描范圍m/z50～1500 Da；噴霧電壓（＋）3.5 kV，（－）3.2 kV；離子傳輸管溫度320℃，AUG 氣體加熱溫度350℃；碰撞能量20、40、60 eV；鞘氣40 psi，輔助氣20 psi，吹掃氣10 psi；RF 鏡頭振幅（s-lens）60；分辨率一級高分辨質譜70 000 FWHM，二級高分辨質譜17 500 FWHM；動態排除時間5 s。

2.2 二至丸樣品及體外對照品溶液的制備

女貞子（酒）、墨旱蓮1∶1 比例混合，加入10 倍量的水，煎煮2 h，收集濾液，殘渣加等量水繼續煎煮1 h，過濾后合并濾液，濃縮成1 g·mL－1（以生藥量計）的藥液。取上述藥液適量加70%的甲醇溶液稀釋10 倍，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得二至丸樣品溶液。

精密稱定紅景天苷、特女貞苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯、芹菜素、齊墩果酸對照品各1 mg于量瓶中，以70%甲醇稀釋10 倍，配成0.1 mg·mL－1的對照品溶液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得體外對照品溶液。

2.3 血液、腦脊液樣品的采集和前處理

SD 大鼠適應性飼養7 d，按體質量隨機分為模型組、空白組，每組6 只，連續4 周模型組腹腔注射D-gal 250 mg/（kg·d），空白組腹腔注射等量的生理鹽水。實驗前禁食12 h，正常飲水，模型組灌胃給予二至丸藥液4.86 g·kg－1，給藥后60 min，微量乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，3000 r·min－1離心10 min，取上清置－80 ℃冰箱保存。取血后，固定大鼠頭部，75%乙醇對頸后部皮膚消毒，微量輸液針從枕骨大孔刺入小腦延髓池，抽取腦脊液于預冷的離心管中，3000 r·min－1離心10 min，取上層腦脊液，－80℃冰箱保存。

取空白血漿和含藥血漿各500 μL 于離心管中，加入2 mL 甲醇，30 μL 乙酸溶液渦旋混合1 min，超聲1 min，13 000 r·min－1離心10 min，取上清液，真空濃縮離心儀1500 r·min－1、40 ℃濃縮至干燥，用150 μL 70%甲醇溶液復溶，過0.22 μm 微孔濾膜，即得血漿待測樣品溶液。取空白腦脊液和含藥腦脊液各200 μL 于離心管中，加入800 μL 甲醇，渦旋混合1 min，超聲1 min，13 000 r·min－1離心5 min，取上清液，真空濃縮離心儀1500 r·min－1、40 ℃濃縮至干燥，用60 μL 70%甲醇溶液復溶，過0.22 μm 微孔濾膜，即得腦脊液待測樣品溶液。

2.4 二至丸成分數據庫的建立及數據處理

在TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）、TCMSP（http://www.tcmsp-e.com/）等中藥成分數據庫中檢索二至丸及其單味藥成分結合相關文獻補充，對二至丸的化學成分信息進行整合匯總建立成分數據庫。數據處理采用Xcalibur 軟件，通過分析保留時間、精確分子質量、元素組成、同位素豐度和一級質譜圖、二級質譜圖，結合二至丸成分數據庫、Pubchem 數據庫、對照品和相關文獻，對化學成分進行辨識分析。

3 結果

3.1 二至丸入血入腦原形化合物的鑒定

應用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術，在正、負離子模式下，對二至丸樣品溶液、大鼠血漿和腦脊液中的成分進行檢測，結果二至丸樣品溶液、血漿和腦脊液總離子流圖見圖1。共發現原形入血成分25 種，原形入腦成分3 種，見表1。

表1 二至丸原形入血、入腦原形化合物信息表Tab 1 Information of prototype blood and brain compounds of Erzhi pills

圖1 正、負離子模式下二至丸TIC 圖Fig 1 TIC for Erzhi pills in both positive and negative ion modes

3.2 二至丸入血入腦原形成分解析

3.2.1 黃酮類化合物 黃酮類化合物結構與雌激素相似，A、B 環上常被甲基、甲氧基等基團取代。在質譜的高強度碰撞過程中，RDA 裂解。CO、CO2等中性分子的丟失是黃酮類化合物的主要裂解特征[20]。實驗中從二至丸給藥血漿中鑒別出黃酮類成分8 個，包括化合物3（20）、4（23）、5（26）、6（28）、7（29）、15、18、24；從給藥腦脊液中鑒別出黃酮類成分1 個，為化合物5（26）。以化合物26（5）和化合物28（6）為例來說明黃酮類化合物的鑒定過程。化合物26（5）保留時間8.52 min，準分子離子峰m/z285.0401 [M-H]－，軟件推測分子式為C15H10O6，主要碎片離子包括m/z151.00 和m/z133.03，是準分子離子峰m/z285.04通過黃酮類化合物的特征性裂解方式RDA 裂解得到的。與文獻報道[9]基本一致，故將其鑒定為木犀草素，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖2。化合物28（6）保留時間為9.26 min，準分子離子峰m/z269.0452 [M-H]－，軟件推測分子式為C15H10O5，主要碎片離子包括m/z225.06、201.06、181.06、159.04、117.03 等，其中m/z225.06 是準分子離子峰失去一個中性的CO2分子所得，進而再失去一個CO2得到m/z181.06 碎片離子。m/z201.06 離子是準分子離子峰丟失C3O2后經氫重排所得，但其結構不穩定易丟失C2H2O 形成穩定的具有共軛結構的離子m/z159.04，m/z159.04 又可丟失C2H2O 生成碎片離子m/z117.03，碎片信息與文獻報道[9]基本一致，故將其鑒定為芹菜素，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖3。

圖2 木犀草素二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 2 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of luteolin

圖3 芹菜素二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 3 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of apigenin

3.2.2 香豆素類化合物 香豆素類化合物結構與雌二醇相似，結構中的內酯和呋喃骨架容易發生CO2和CO 的中性丟失[17]。從二至丸給藥血漿中鑒別出香豆素類成分2 個，即化合物22 和27；從給藥腦脊液中鑒別出香豆素類成分1 個，為化合物27。以化合物27 為例，說明香豆素類化合物的鑒定過程。化合物27 保留時間為8.78 min，軟件得到準分子離子峰為m/z313.0351[M-H]－，推測分子式為C16H10O7，質譜掃描獲得碎片離子m/z298.01、270.02、254.02 等，分別是準分子離子峰依次丟失CH3、CO、CO2所得，與文獻報道[17]基本一致，故將其鑒定為蟛蜞菊內酯，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖4。

圖4 蟛蜞菊內酯二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 4 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of wedelolactone

3.2.3 苯乙醇苷類化合物 苯乙醇苷是一類以取代苯乙醇為苷元的苷，其成苷的中心葡萄糖基常連有芳香酰基[10]。實驗從二至丸給藥血漿中鑒別出苯乙醇苷類化合物2 個，即化合物10 和11；從給藥腦脊液中亦鑒別到化合物11。化合物11 保留時間為3.39 min，準分子離子峰為m/z299.1153 [M-H]－，軟件推測分子式為C14H20O7，質譜掃描得到碎片離子m/z179.05 和m/z119.05，分別為葡萄糖基碎片和酪醇-OH 的碎片離子，與文獻報道[10]基本一致，故鑒定其為紅景天苷，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖5。

圖5 紅景天苷二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 5 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of salidroside

3.2.4 萜類化合物解析 萜類以異戊二烯單位（C5單位）為基本骨架[8]，根據分子中C5單位的數量分為單萜、二萜、三萜等，在二至丸給藥血漿中共鑒別出萜類化合物3 種，即化合物1、8（30）、31。以化合物30 為例，說明萜類化合物的鑒定過程。化合物30 保留時間為16.45 min，準分子離子峰m/z455.3531 [M-H]－，軟件推測分子式為C30H48O3，m/z391.23 是準分子離子峰失去一分子H2O 和HCOOH 得到的離子碎片，與文獻報道[8]基本一致，故將其鑒定為齊墩果酸，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖6。

圖6 齊墩果酸二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 6 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of oleanolic acid

3.2.5 裂環環烯醚萜類化合物 環戊并吡喃是裂環環烯醚萜類化合物的特征結構，在質譜碰撞過程中該結構的鍵會發生斷裂。裂環環烯醚萜類化合物側鏈上的官能團也常以CH3OH、H2O、CO2和糖分子的形式丟失[9]。在二至丸給藥血漿中共鑒別出裂環環烯醚萜類化合物3 種，即化合物16、19、21。化合物21 保留時間為7.03 min，準分子離子峰為m/z685.5621 [M-H]－，推測其分子式為C31H42O17，質譜掃描獲得主要離子碎片包括m/z523.18、453.14、421.15 等。準分子離子峰失去一分子C4H6O 產生m/z453.14 碎片，再失去一分子CH3OH 得到m/z421.15 碎片，m/z453.14、m/z421.15 及分子離子峰失去一分子葡萄糖得到的m/z523.18 碎片都是裂環環烯醚萜類裂解的典型片段。與文獻報道[9]基本一致，故將其鑒定為特女貞苷，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖7。

圖7 特女貞苷二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 7 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of nuezhenide

4 討論

多成分、多靶點是二至丸復方體系的重要特點，也給二至丸治療AD 的藥效物質基礎研究帶來了挑戰。經典復方體系研究往往以體外成分為研究對象[13]，血漿等內環境對中藥復方成分的影響就很容易被忽視。因此，實驗采用具有較強分離、檢測能力的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術對二至丸的入血入腦成分進行檢測。二至丸成分復雜多樣，在血漿和腦脊液的復雜體系影響下更容易發生改變，為了最大程度獲取樣品中化合物的質譜信息，實驗采用了正、負兩種離子化采集模式。結果在給藥血漿中鑒定出黃酮類、香豆素類、苯乙醇苷類、三萜類等多種類型的成分，研究發現黃酮類成分木犀草素和芹菜素都具有促進神經元修復和再生的神經保護作用[21-22]。香豆素類成分蟛蜞菊內酯具有調節氧化應激和線粒體功能障礙從而保護神經退行性病變的作用[23]。苯乙醇苷類成分紅景天苷對大腦神經可塑性的調節作用也不容忽視，神經元突觸的活性依賴降低能夠被其抑制[24]。Guo 等[25]研究發現三萜類成分齊墩果酸能夠調節亞錫鈣蛋白-1 和解偶聯蛋白-2信號而緩解AD 中的氧化應激和Aβ沉積。Zhang等[26]研究發現裂環環烯醚萜類成分梔子苷能夠下調mTOR 信號，使Aβ纖維的自噬和溶酶體清除增強。酚酸類成分原兒茶酸和咖啡酸也被證實具有改善神經炎癥[27]，減少Aβ聚集[28]，進而改善AD 學習記憶障礙的藥理作用。此外，在給藥腦脊液中還鑒定出木犀草素、紅景天苷、蟛蜞菊內酯3 種成分，提示它們對改善D-gal 模型大鼠學習記憶障礙的過程中的貢獻可能更大。

目前，關于二至丸發揮改善D-gal 模型大鼠學習記憶障礙的具體作用機制和代謝途徑研究還不明確，在后續研究中，作者將進一步考察這些入血尤其是入腦成分的生物活性和代謝途徑，并進行血液和腦脊液的藥動學監測，明確具體的量效關系，為更好地闡明體二至丸治療AD 的體內藥效物質和作用機制提供實驗依據。