高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定杜仲平壓分散片中6種成分的含量

胡小祥，王繼威，劉冠瓊，何艷（.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 郴州 423000；2.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423099）

杜仲平壓分散片是由杜仲葉單味藥材經(jīng)水煎煮、醇沉、濃縮制成的片劑，具降血壓，強(qiáng)筋健骨之功效，臨床用于治療高血壓和骨質(zhì)疏松病。杜仲葉含有多種有效成分，主要有苯丙素類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)和黃酮類(lèi)成分[1]，其中苯丙素類(lèi)主要有綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸等[2-3]，環(huán)烯醚萜類(lèi)主要有京尼平苷酸等[4]，黃酮類(lèi)主要有蘆丁、異槲皮苷等[5-6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸具有利膽、抗炎、抗病毒、降血壓等功效[7-8]。京尼平苷酸具有抗炎、抗骨質(zhì)疏松等功效[9-10]。蘆丁、異槲皮苷具有降血壓、抗骨質(zhì)疏松等作用[11-12]。杜仲平壓分散片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定，而相關(guān)文獻(xiàn)也僅測(cè)定綠原酸的含量[13]，涉及的活性成分有限。因此，為了更加全面地反映該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，本研究采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定制劑中京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷的含量，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Mettler XSE-205 型十萬(wàn)分之一電子天平（精度：0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KQ-500D超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品京尼平苷酸（批號(hào)：111828-201805，純度：98.1%）、綠原酸（批號(hào)：110753-202018，純度：96.1%）、蘆丁（批號(hào)：100080-201811，純度：92.4%）、異槲皮苷（批號(hào)：111809-201804，純度：97.2%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院），對(duì)照品新綠原酸（批號(hào)：MUST-21030108，純度：99.67%）、隱綠原酸（批號(hào)：MUST-21082601，純度：99.88%）（成都曼思特生物科技有限公司）。乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；磷酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為怡寶純凈水。杜仲平壓分散片（批號(hào)：201105、210101、210601、210701，規(guī)格：0.55 g/片，湖南方盛制藥股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo Hypersil Gold-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，5%～18%A；18～25 min，10%～16%A；25～35 min，16%A；35～40 min，16%～25%A，40～41 min，25%～5%A，41～45 min，5%A）；流速為1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm（京尼平苷酸）、327 nm（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸）、354 nm（蘆丁、異槲皮苷）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷6.85、12.50、11.81、13.18、5.85、5.31 mg，分別置25 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各儲(chǔ)備液1、2、3、2、1、1 mL，置同一10 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為26.88、99.67、136.2、105.3、21.62、20.65 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取杜仲平壓分散片10 片，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱(chēng)重，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0.45 μm 濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按杜仲平壓分散片處方工藝，制成只含輔料的陰性樣品。取陰性樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下的3 種溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品色譜圖中京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷6 個(gè)成分在與混合對(duì)照品色譜圖相同的保留時(shí)間上有色譜峰出現(xiàn)，與相鄰色譜峰之間達(dá)到較為理想的分離效果，分離度均大于1.5，陰性樣品無(wú)干擾，表明方法專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖1。

圖1 杜仲平壓分散片的HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Duzhong Pingya dispersible tablets

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限考察 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，分別精密吸取1、2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度得系列對(duì)照品溶液，分別取適量，進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)。結(jié)果6 種成分在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)表1。另取混合對(duì)照品溶液適量，用50%甲醇逐步稀釋?zhuān)?dāng)S/N為3∶1 時(shí)測(cè)得檢測(cè)限（LOD），當(dāng)S/N為10∶1 時(shí)測(cè)得定量限（LOQ），見(jiàn)表1。

表1 6 種成分的線(xiàn)性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限Tab 1 Linearity，LOD and LOQ of 6 components

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取線(xiàn)性曲線(xiàn)第3 個(gè)點(diǎn)的對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.24%、0.10%、0.43%、0.28%、0.26%和0.21%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為210101 的樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、12、16、21 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品中京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.95%、0.29%、0.32%、0.27%、0.62%和0.69%，表明供試品溶液在21 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為210101 的樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量。結(jié)果京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷含量的平均值分別為0.2402、1.338、2.380、1.629、0.1395、0.2066 mg·g－1，RSD分別為0.17%、0.43%、0.65%、0.61%、1.2%、1.6%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取含量已知的杜仲平壓分散片（批號(hào)：210101）的樣品，研細(xì)，取約0.75 g，精密稱(chēng)定，共6 份。按上述6 個(gè)成分含量的100%分別加入各單一對(duì)照品溶液（0.1882 mg·mL－1京尼平苷酸1 mL、0.3321 mg·mL－1新綠原酸3 mL、0.4540 mg·mL－1綠原酸4 mL、0.4099 mg·mL－1隱綠原酸3 mL、0.1081 mg·mL－1蘆丁1 mL、0.1652 mg·mL－1異槲皮苷1 mL），剩余體積用50%甲醇補(bǔ)足，然后按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的回收率。結(jié)果京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷平均加樣回收率分別為99.16%、100.86%、104.76%、104.12%、101.13%、101.80%，RSD分別為1.6%、1.8%、1.1%、1.1%、2.3%、2.0%。

2.5 樣品含量測(cè)定

取杜仲平壓分散片樣品4 批，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，通過(guò)回歸方程計(jì)算供試品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 杜仲平壓分散片中各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g－1，n＝2)Tab 2 Content of each ingredient in Duzhong Pingya dispersible tablets (mg·g－1，n＝2)

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

采用DAD 檢測(cè)器分別對(duì)6 個(gè)成分在200～400 nm 內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷分別在238、327、327、327、354、354 nm 處有最大吸收，兼顧各色譜峰出峰時(shí)間，故選擇238 nm（檢測(cè)京尼平苷酸）、327 nm（檢測(cè)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸）、354 nm（檢測(cè)蘆丁、異槲皮苷）作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相體系進(jìn)行考察[14-16]，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相體系時(shí)，6 個(gè)成分色譜峰峰形、分離度最好，當(dāng)增加磷酸濃度時(shí)，6 個(gè)成分色譜峰峰形無(wú)明顯變化，故選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。再考察不同色譜柱[Agilent ZORBAX SB C18、Waters sunfire C18、Thermo Hypersil Gold-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、不同溫度（25、30、35 ℃）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min－1）對(duì)6 個(gè)成分測(cè)定的影響，結(jié)果在上述條件下，6 個(gè)成分均達(dá)到了較好的分離，說(shuō)明方法耐受性較好。

3.3 提取方法的選擇

預(yù)試驗(yàn)考察了不同提取溶劑（乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇）對(duì)6 個(gè)成分提取效果的影響，結(jié)果不同乙醇濃度提取的供試品色譜峰峰形有不同程度的拖尾，而以50%甲醇提取的供試品各成分峰形較佳，提取率最高。還考察了超聲和回流兩種提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲提取用時(shí)明顯短于回流提取，且超聲提取30 min 時(shí)，6個(gè)成分基本提取完全。最后考察50%甲醇用量（50、100 mL）對(duì)6 個(gè)成分提取的影響，發(fā)現(xiàn)兩種體積下6 種成分的含量基本成比例，故最終確定供試品溶液制備方法為50%甲醇50 mL 超聲提取30 min。

3.4 小結(jié)

本試驗(yàn)建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定杜仲平壓分散片中京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷的含量，涵蓋了該制劑中與功能主治一致的主要有效成分，該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量控制方法的完善提供依據(jù)。