分子標記技術在農作物種子檢測中的應用

王玉杰 冷春旭 孫中義 王 珣 趙 曦 李曉娟 趙 偉 吳立成

（1 黑龍江省農業科學院生物技術研究所，哈爾濱 150028；2 黑龍江省作物與家畜分子育種重點實驗室，哈爾濱 150028）

種子是現代農業發展的“芯片”，是國家糧食安全和農業高質量發展的“源頭”。2020年中央經濟工作會議將解決好種子和耕地問題作為年度經濟工作重點任務，鑒定種子質量是保障農業安全生產的重要工作之一，而種子純度和真實性是種子質量控制中最難解決的問題。種子的純度和真實性鑒定本質上就是品種基因型的鑒定，DNA 分子標記技術通過比較不同個體基因組DNA 序列差異來鑒定品種。

DNA 分子標記多態性的產生是由于DNA 分子出現插入、缺失、倒位、異位、重排和置換等排列造成的核苷酸差異。與傳統形態標記、生化標記相比，具有分布廣、多態性高、準確性高、操作快速簡便、不受外界環境影響等優點。目前分子標記技術已成為作物純度和真實性鑒定應用最廣泛的技術。

1 分子標記技術的發展歷程

分子標記技術是以DNA 多態性為基礎的一種遺傳標記，為農作物種子質量分析提供了更為準確、可靠、方便、快捷的方法。分子標記的發展經歷了從以Southern 雜交為基礎的第1 代限制性片段長度多態性（RFLP，Restriction fragment length polymorphism）標記到以PCR 反應為基礎的2 代隨機擴增多態性（RAPD，Random amplified polymorphic DNA）、擴增片段長度多態性（AFLP，Amplified fragment length polymorphism）、簡單重復序列（SSR，Simple sequence repeat）和以測序為基礎的第3 代單核苷酸標記（SNP，Single nucleotide polymorphism）。

1.1 RFLP 技術RFLP 作為第1 代分子標記于1980年被Bostein 等[1]發現，其原理是限制性內切酶識別并切割基因組DNA，經PAGE 電泳后，應用特定探針進行Southern 雜交，最后通過放射自顯影獲得RFLP 圖譜。RFLP 標記具有穩定性高和共線性強等優點，但是隨著PCR 技術的誕生和發展，RFLP 逐漸被淘汰，目前已不再應用該技術。

1.2 RAPD 技術RAPD 技術是以PCR 為基礎發展起來的第2 代分子標記技術，于1990年被Welsh等[2]發現，其原理是利用單一隨機引物將基因組中存在的重復序列之間的片段進行PCR 擴增，產物經凝膠電泳及染色即可顯示多態性。與第1 代RFLP標記相比具有通用性強、成本低和檢測方便等優點，而RAPD的缺點是反應條件敏感，穩定性和重復性差，無法用于基因分型。

1.3 AFLP 技術AFLP 標記是在RFLP 和RAPD標記技術基礎上發展起來的技術，于1993年被Zabeau 等[3]發明，其原理是利用限制性內切酶切割基因組DNA 后，酶切片段在T4 連接酶的作用下與特定的接頭連接，最后進行預擴增和選擇性擴增，產物經電泳及染色顯示多態性。AFLP 標記綜合了RFLP 和RAPD 兩種標記技術的優點，具有樣品需求少、穩定性高、可靠性好且多態性高等特點，缺點是試驗費用高、對DNA的質量要求較高。

1.4 SSR 技術SSR 也稱為微衛星序列，是以1～6 個堿基為基序，經過串聯重組而組成的DNA 序列，廣泛存在于植物基因組[4]。其原理是利用SSR 兩側的保守序列為模板，設計特異引物，當SSR 重復的次數不同或者不完全重復時，經PCR 擴增及電泳分離，即可獲得該位點的多態性。SSR 標記的優點是多態性豐富，穩定性和重復性好，且為共顯性標記，可用于基因分型，缺點是開發成本高、費時費力。

1.5 SNP 技術SNP 是在SSR 標記基礎上發展的第3代分子標記，于1996年由Eric S.Lander等發明，SNP 是指不同生物個體DNA 序列中單堿基差異，包括單個堿基的插入、缺失、轉換和顛換等類型[5]。其原理是利用特異性的引物對某一基因進行PCR 擴增，檢測SNP 位點信息，進行基因分型。SNP 分子標記技術具有遺傳穩定性高、分布均勻、數量多、通量高、檢測快和可實現自動化等優點，缺點是易出現假陽性、成本高，且必須在全基因測序的基礎上進行分析。

2 分子標記在農作物種子檢測中的應用

分子標記技術直接以種子DNA 作為研究對象，彌補和克服了傳統農作物種子鑒定方法的不足，具有不受環境條件影響、操作簡便快捷、數據穩定可靠等優點。近年來，在農作物種子質量檢測中越來越受到重視。RFLP 標記因為DNA 用量大，技術復雜且檢測過程中需要放射性同位素不便操作，所以不適合快速檢測種子純度和品種的真實性；RAPD 標記由于引物篩選工作量大，多態性不足，對品種的鑒定難度大，導致該標記很少應用到大規模的種子鑒定中；AFLP 標記兼具PCR的高效性與RFLP的可靠性，多態性強，可分析較大基因組作物，非常適合鑒定作物品種的真實性和純度，但是操作程序復雜，需要很高的實驗技能和精密的儀器，因此很難在作物種子質量鑒定中普及推廣；SSR 標記既有RFLP的遺傳學優點，又比RAPD的可信度高，還比AFLP標記操作簡單、穩定性好，已成為可高效準確檢測種子純度和真實性的熱點技術。2014年我國頒布了水稻、玉米、大豆3 個作物的品種鑒定技術規程-SSR 分子標記法的農業行業標準。SNP 標記具有重復性好、覆蓋面廣、遺傳穩定性強等優點，特別適合親緣關系較近和遺傳背景復雜的品種鑒定，尤其適合大量樣本檢測，在種子質量檢測中越來越受到重視，擁有廣闊的應用前景。

2.1 分子標記應用于種子真實性檢測種子的真實性是指一批種子所屬品種、種或屬與該品種審定時所描述的內容是否一致，是衡量種子質量的指標之一。品種真實性鑒定包括真實性驗證和真實身份鑒定，真實性驗證是把待測樣品與對應的標準樣品比較，檢驗兩者是否相同；真實性身份鑒定是將待測樣品與DNA 指紋數據庫比對，確定樣品的品種名稱。傳統鑒定種子真實性的方法主要是田間種植鑒定和蛋白質電泳等，而分子標記以DNA 多態性為基礎，比傳統鑒定方法更加快速高效，已廣泛應用于種子真實性檢測。

李雪等[6]利用40 對SSR 引物和3072 個SNP位點對11 套玉米雜交種和親本進行鑒定，結果表明SSR 和SNP 在種子真實性鑒定方面具有較好的一致性；陳廣鳳等[7]利用SNP 分子標記對205 份小麥進行基因分型，結果表明SNP 標記在檢測種子真實性、位點穩定性、品種區分能力以及遺傳關系分析等方面準確可靠、快捷有效。進行真實性身份鑒定須建立DNA 指紋數據庫，2010年農業部啟動玉米、水稻、小麥、棉花、大豆等主要農作物標準樣品的征集工作，為標準樣品DNA 指紋庫的構建提供了可靠的樣品[4]。王鳳格等[8]利用40 對SSR 核心引物對3998 份玉米審定品種標準樣品構建了DNA 指紋圖庫，建立了玉米品種標準指紋比對服務平臺。

2.2 分子標記技術應用于種子純度檢測種子純度是衡量種子質量的另一個重要指標，也是影響作物品質和產量的關鍵因素。據統計，玉米種子純度合格率每下降1%，產量下降3%[9]。種子純度鑒定包括田間鑒定法、生化標記法以及DNA 分子標記法，其中分子標記法因其具有準確性高、穩定性好和重復性強等優點而廣泛應用于作物自交系和雜交種純度鑒定。

Smith 等[10]利用RFLP 鑒定了78 個玉米雜交種的純度，Shimornura 等[11]研究發現2 對SSR 引物可區分10 個日本主栽草莓品種，Tommasini 等[12]利用3 組SSR 引物區分10 個油菜品種。吳明生等[13]發現1 個SNP 多態性位點可將2 個雜交玉米品種中混雜的親本區分出來，匡猛等[14]從63K的棉花全基因組芯片中應用KASP 技術選出26 個雜合率高且分型效果理想的SNP 核心位點，進行棉花雜交種純度檢測。研究表明，SNP 檢測種子純度靈敏度更高，能將親緣關系較近和遺傳關系復雜的品種明確區分出來，特別適用大量樣品檢測。

3 展望

分子標記技術與傳統檢測方法相比具有快速、準確，不受環境影響等優點，目前已廣泛應用于作物種子檢測，大大提高了鑒定的效率，有效保障了種子的真實性和純度，為實現農業安全生產，促進種業市場規范發展，推動農民增收貢獻了力量。隨著分子標記技術的發展，更多高效的新型分子標記將逐步被挖掘，種子檢測體系也將不斷地完善和成熟，為打擊非法套牌及制售假劣種子提供了科技支撐，保障了我國的糧食安全。