食品微生物檢測實驗室標準菌株的管理和質量控制

詹 清，鄭孝賢，王海龍，林夢丹，方東升

（福建省微生物研究所，福建福州 350000）

隨著人們對食品安全問題的日漸關注，食品微生物檢驗的市場需求擴大，同時也對檢驗機構的人員和專業技術手段提出了更嚴格的要求。標準菌株作為微生物檢測工作的關鍵因素，是檢測質量內部控制的一部分[1]。標準菌株是一類遺傳學特性已得到確認和保證，并且可溯源的模式菌株，其在培養基和試劑的質量驗收、檢測方法的確認和證實以及確保檢測結果的準確性等各方面都具有不可替代的重要作用[2]。本文結合實驗室的檢測工作實際，對食品微生物檢測實驗室標準菌株的日常規范化管理以及質量控制進行探討。

1 標準菌株的來源

依據《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》（CNAS—CL01-A001：2018）的規定，實驗室必須有保藏滿足實驗需要的標準菌株，除特殊檢測方法（如抗菌實驗或藥敏實驗）用到的菌株外，還需具備用于培養基（試劑）驗收/質量控制、方法確認/證實、陽、陰性對照、人員培訓考核和結果質量的保證等需要的菌株，且標準菌株應該從國際或國家認可的菌種保藏機構購買[3]。目前，我國的微生物檢測實驗室所用的標準菌株主要來自以下機構，美國典型菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）、中國醫學細菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）、中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）和廣東省微生物菌種保藏中心（Guangdong Microbial Culture Collection Center，GDMCC）[4]。

2 標準菌株的選擇

由于標準菌株種類繁多，同種或同一亞種的不同菌株的某些生物學特性可能會存在一些差別。因此，在選擇菌株的時候不僅要注意菌株的名稱，還要注意菌株的編號。如銅綠假單胞菌ATCC27853和銅綠假單胞菌ATCC15442二者產生綠膿菌素的能力差異較大。食品微生物檢測實驗室可根據所開展的檢測項目，參照食品安全國家標準GB 4789系列，選擇標準規定的菌株作為檢測實驗的陰、陽性對照[5]。另外，《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）規定了不同種類培養基的質量控制標準，并指定了相應的標準菌株作為質控菌株[6]。

3 標準菌株的驗收

實驗室收到標準菌株時，首先應核對菌株的數量和名稱，同時檢查菌株附有的相關資料以及每一支菌株包裝的完整性，并在菌株接收記錄上登記相關信息，如菌株名稱、數量、菌號、來源途徑和接收日期等。同時給每支菌株粘貼標簽，標簽內容包括菌種名稱、菌號、代次、接收日期、接收人、貯存條件及有效期至，新購入的原始菌株依照隨產品附有的菌株儲存方法進行儲存。

4 標準菌株的復活、傳代及確認

4.1 標準菌株的復活

得到標準菌株后，應盡早進行復活和保藏。在進行復活前，要根據菌株的特性，確定培養基與培養條件。通常從菌種保藏機構購買的標準菌株會附帶操作說明，可直接按照說明書進行復活。若沒有附帶說明書，可通過查閱文獻等方式確認菌株營養需求和生長條件。在復活標準菌株時，應嚴格按照《人間傳染的病原微生物名錄》《病原微生物實驗室生物安全管理條例》《動物病原微生物分類名錄》及《實驗室 生物安全通用要求》（GB 19489—2008）的規定，在相應的生物安全水平下操作。從菌種保藏機構購買的標準菌株通常是凍干粉狀態，可選擇加入少量生理鹽水或復蘇液（購買菌株包裝中提供），將凍干菌種制成懸浮液，然后用無菌滴管或移液器吸取適量移至固體培養基平板（或液體培養基）中進行培養。

4.2 菌株的性能確認

為了保證標準菌株的質量，菌株經過復活，并在適宜的培養基中生長后，需進行純度和性能的確認，同時做好確認記錄。純度檢查通常采用平板劃線法，用無菌接種環將復活后的菌株劃線于相應的鑒別平板或非選擇平板上，分離出單菌落，觀察單菌落形態是否與菌株特征相符。然后取平板上的單菌落進行革蘭氏染色，染色結果應符合要求。最后利用生理生化試驗鑒定菌株的性能。常見的生化鑒定產品有API生化鑒定試劑盒和標準菌株生化鑒定試劑盒，也可借助全自動細菌生化鑒定儀等儀器進行鑒定。

4.3 菌株的傳代

從菌種保藏機構購買回來的標準菌種通常為0代，將0代標準菌株轉接一代后得到的一套完全相同的獨立菌株，即標準儲備菌株。將標準儲備菌株再轉接一代即可獲得工作菌株，理論上工作菌株傳代不超過5代[7]。每次傳代需填寫傳代確認記錄表，記錄表內容應包括菌株名稱、編號、代數、制成代編號、培養基、培養溫度及時間、純度檢查過程、鏡檢、生化鑒定結果和操作者等信息，以保證傳代后菌株質量的可控性。制備的菌株應由管理員統一進行標簽標識，標簽內容包括菌株名稱、內部編號、傳代日期及有效期等信息。內部編號規則通常采用字母加數字表示，即菌株拉丁文縮寫字母+代次+傳代日期+順序號。

5 標準菌株的保藏

菌株保藏的主要目的是為了保持原菌株的活力和特性，降低菌株的變異和污染[8]。一種良好有效的保藏方法要能保持原菌株的優良特性長期穩定，同時操作上還須具備簡便性和經濟性等特點。食品微生物檢測實驗室常用的菌株保藏方法有以下幾種。

5.1 斜面低溫保藏法

將菌株接種在適宜的斜面培養基上，待菌株生長完全后，轉至2～8 ℃的冰箱保藏（需常溫保存的菌株除外，如銅綠假單胞菌和霍亂弧菌等）。此法常用于工作菌株的保藏，一般可保存3個月左右（不同種類菌株保存周期略有不同）。該方法的優點是操作簡便、易推廣、存活率高。缺點是保藏周期短、菌株隨著傳代次數的增加容易發生變異或引入污染。

5.2 液體石蠟保藏法

在斜面保藏法的基礎上，加入滅過菌并已蒸發掉水分的液體石蠟，垂直放置使石蠟高出斜面頂端l cm，將培養物與空氣隔絕，以此達到保藏效果。此方法的優點是操作簡單，保存時間長，一般可保存1～2年。缺點是不適用于能分解烴類的菌株保存，且斜面占用空間大。

5.3 甘油懸液保藏法

用滅過菌的甘油（濃度為15%～20%），將新鮮的純培養物洗脫下來，混合均勻，再分裝至菌種保藏管中，置于-20 ℃低溫保存，一般可保存1年以上。本方法操作簡單，不需特殊設備，不需反復傳代，使用方便。

5.4 冷凍真空干燥保藏法

冷凍真空干燥保藏法簡稱凍干法，它是將需保藏菌株的細胞懸液或孢子懸液與保護劑混合，然后置于安瓿管中，在低溫條件下快速凍結，并減壓抽真空，使水分升華將樣品脫水干燥，制成完全干燥的固體菌塊。在真空條件下將安瓿管立即熔封，最后置于低溫冰箱保存。此方法的優點是保存周期長，一般可達5年以上，菌株存活率高、變異率低。缺點是該方法操作煩瑣，且需要凍干機等專用設備。

6 標準菌株的領用及銷毀

食品檢測實驗室的標準菌株應由專人保管，領用標準菌株、標準儲備菌株和工作菌株時要做好交接工作，并填寫領用記錄表，記錄表內容應包括菌株名稱、編號、使用日期、用途、使用人和管理人簽字確認等?！秾嶒炇?生物安全通用要求》（GB 19489—2008）規定了生物安全實驗室處置廢棄物的要求，標準菌株使用完畢后相關污染物品應進行嚴格的消毒滅菌處理，并記錄。

7 標準菌株的期間核查

標準菌株是一類易發生死亡、衰退和被污染的標準物質[9]。為確保標準菌株相關生物學性能的穩定，微生物檢測實驗室應制定詳細的標準菌株期間核查計劃，對菌株核查的方法、頻次、文件記錄、結果判定等方面內容進行合理規定。實驗室可根據工作實際情況對保存的標準菌株進行核查，主要包括文件的核查和標準菌株純度、活性、穩定性和生化特性等指標的核查[10]。文件核查的主要工作是查閱菌株檔案以及相關記錄的完整性，包括菌株溯源證明、標準菌株臺賬、傳代及確認記錄和領用及銷毀記錄等。標準菌株純度、活性、穩定性和生化特性的核查可參考菌株的性能確認方法，一般情況下，菌株性能的期間核查與常規標準菌株的確認方法和依據基本一致，但期間核查可從多方面使用不同的方法進行，并不局限于單一的方法。

8 結語

標準菌株作為重要且特殊的標準物質，貫穿于整個微生物檢測過程，并起到內外部質量控制的作用。微生物檢測實驗室應建立一套完善的標準菌株管理和質量控制程序，確保標準菌株的溯源性和穩定性，從源頭上保證檢測結果的有效性和真實性。