外源赤霉素與氯化鈣對哈茨木霉生長的影響

俞春錦

（山東陽谷縣農業農村局，山東 陽谷 252300）

長期大量使用化學農藥對生態環境和人類健康已經產生了巨大危害。利用生物防治菌作為生物殺菌劑的生物防治方法可以有效地克服這些弊端，因而生物農藥越來越受到人們的重視。其中拮抗微生物在植物病蟲害生物防治中的應用備受人們關注[1-2]。在目前已發現的拮抗微生物中，木霉菌（Trichoderma spp.）具有很好的生防活性。

木霉菌（Trichoderma spp.）是防治植物病原真菌病害的重要生防因子。按傳統分類系統，隸屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、絲孢科[3]。木霉適應性廣，幾乎在所有種植農作物的土壤中都有木霉真菌存在，其廣泛存在于根圍、葉圍、種子和球莖等生態環境中[4]。自從Weinding首先發表了木霉菌對多種植物病原菌具有拮抗作用以來[5]，目前已研究發現木霉至少對18 個屬29 種植物病原真菌在體外或體內表現有拮抗作用，以哈茨木霉的使用最為廣泛。近年來人們發現，除了在生物防治方面有很重要的作用之外，哈茨木霉還在促進植物生長、誘導植物產生抗病性、降低連作障礙等方面有一定的作用[6]。

但是哈茨木霉菌的產量低成為制約哈茨木霉菌發展應用的重要因素。常用的哈茨木霉（T. harzianum）的培養過程為：先通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）進行一級培養后，再將孢子洗脫后植入麥麩中進行二級培養，形成麥麩制劑。近年來，對于哈茨木霉菌的液體培養技術研究主要集中在二級培養階段，但是一級培養技術培養周期長、成本高，在一定程度上制約了哈茨木霉的規模生產，同樣需要進一步的改進和完善[7]。

赤霉素（GA3）最早是從赤霉菌培養基的濾液中分離出的活性物質，在植物體內具有提高生長素含量、促進細胞伸張、促進細胞分裂、促進細胞擴大的作用[8-11]。

鈣離子是機體維持各項生理活動不可缺少的離子。在動物體內鈣離子對于維持細胞膜兩側的生物電位、神經傳導功能、肌肉伸縮與舒張功能以及神經-肌肉傳導功能、激素的作用機制等方面具有重要作用[12]。在植物生長方面，鈣離子作為植物細胞的第二信使，與植物的代謝調控、極性建立、細胞伸長、氣孔關閉、生長發育等很多方面有關[13-14]。有研究表明，鈣離子能夠促進真菌對一些元素的吸收并能夠促進真菌的生長，因此對于哈茨木霉菌的生長應有同樣作用[15]。本試驗通過在培養基中添加不同質量濃度的GA3和CaCl2，探討了GA3和CaCl2對哈茨木霉生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基購自遠慕生物公司、哈茨木霉菌由山東大學微生物重點試驗室提供。

1.2 方法

分別在PDA 培養基中添加GA3和CaCl2的質量濃度為 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.2 mg/L，以不添加 GA3和 CaCl2的培養基為對照（CK）。在無菌操作臺上，利用直徑為0.392 cm 的打孔器進行接種哈茨木霉菌。在無菌人工氣候培養箱中無光25℃下培養，每天進行菌落直徑的測定。

2 結果與分析

2.1 GA3 對哈茨木霉菌生長的影響

試驗結果表明，培養24 h 后，不同質量濃度GA3溶液處理的PDA 培養基造成哈茨木霉菌落直徑大小順序為：0.8 mg/L＞0.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.4 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L，GA3質量濃度為 0.1、0.2 和 0.8 mg/L 時均可明顯促進哈茨木霉菌生長，其中0.8 mg/L 的GA3處理下哈茨木霉菌的直徑是對照的1.42 倍，統計分析表明與對照相比差異極顯著；質量濃度為0.4、1.2 mg/L 時同樣促進哈茨木霉菌落的生長，但促進作用相對較低。因此，在前24 h，GA3溶液對促進哈茨木霉菌落的最適質量濃度為0.8 mg/L，質量濃度范圍為 0.4～0.8 mg/L。

培養36 h 后，不同質量濃度GA3溶液處理的PDA培養基造成哈茨木霉菌落直徑大小順序為：0.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.8 mg/L＞0.4 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L，GA3質量濃度為0.1 mg/L 和0.2 mg/L 時均可明顯促進哈茨木霉菌生長速度；0.2 mg/L 的GA3處理下哈茨木霉菌的直徑是對照的1.35 倍，質量濃度為0.4、0.8 mg/L 時同樣促進哈茨木霉菌落的生長，但促進作用相對較低；各處理與對照差異極顯著（圖1）。

圖1 GA3 對哈茨木霉菌落直徑的影響

2.2 CaCl2 對哈茨木霉菌生長的影響

CaCl2對哈茨木霉菌生長的影響如圖2 所示，試驗結果表明，培養24 h 后，不同質量濃度鈣離子溶液處理的哈茨木霉菌落直徑大小順序為：0.2 mg/L＞0.4 mg/L＞0.8 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L＞0.1 mg/L，鈣離子質量濃度為0.2 mg/L 時促進哈茨木霉菌生長速度不明顯，在添加0.2 mg/LCaCl2的平板中菌落直徑僅是對照的1.04 倍。

圖2 CaCl2 對哈茨木霉菌落直徑的影響

培養36 h 后，添加了不同質量濃度CaCl2的PDA 培養基中哈茨木霉菌落直徑大小順序為：0.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.8 mg/L＞0 mg/L＞1.2 mg/L＞0.4 mg/L，鈣離子質量濃度為0.2 mg/L 時可促進哈茨木霉菌生長，此時培養基中菌落直徑僅為對照的1.08 倍。鈣離子質量濃度為1.2 mg/L和0.4 mg/L 時可抑制哈茨木霉菌生長，此時培養基中菌落直徑比對照分別減小了0.03 和0.29倍。

3 結論與討論

近年來，國內外學者對哈茨木霉菌培養條件的優化進行了很多研究。王慧中等[16]通過淺層液體培養技術對哈茨木霉菌的最適pH 做了研究，指出了最適pH 在4～6之間；王慧中等[17]利用蟲草頭孢發酵廢液為母液制成的組合培養液培養哈茨木霉，其培養效果明顯優于其他培養液，為工業化生產哈茨木霉提供了新思路。蔡愛群等[18]對鈣、鐵和錳對2 種靈芝液體培養菌絲體生物量影響的研究表明鈣離子對松杉靈芝在Ca 質量濃度為200 mg/L時生物量最高，指出鈣離子對真菌生長有一定的影響。

但是固體培養技術，尤其是關于植物激素和鈣離子對哈茨木霉生長的研究多沒有涉及。本試驗是通過不同質量濃度的GA3和鈣離子分別對哈茨木霉菌的固體培養做出研究，通過觀察菌落的直徑來探討其對哈茨木霉菌生長的影響，從而揭示植物激素和鈣離子對哈茨木霉菌是否具有相互作用。為進一步研究促進哈茨木霉菌產量的培養基提供重要參考。