油棗中黃酮類化合物體外抗凝血活性分析

王爭爭，趙 邑，王如福

（1.山西省生物研究院有限公司/醫藥生物技術山西省重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801）

油棗至今已超過1 000 a的栽培歷史，康熙年間被封為貢品[1]。油棗樹抗旱、抗寒、抗病、耐澇能力較強，適合在北方暖溫帶，海拔1 000 m以下，年均溫度在8℃以上，干旱、半干旱地區生長[2]。其果實營養豐富，含有黃酮、多糖、三萜酸等多種生物活性成分[3]，具有防癌抗癌、防止心血管疾病、抑菌保肝、增強免疫力等功能[4]。

近年來，國內外人群心腦血管疾病的發病率和死亡率不斷提升，而血栓性疾病在其中是最為常見的。現階段，抗血栓的藥物主要有抗凝血類藥物、抗血小板類藥物和溶栓類藥物3種。由于其發病機理復雜，發病因素多樣，單一的化學藥物較難有全面的治療效果，而且經常會出現不良反應。目前，在臨床治療時，多用肝素和香豆素類作為抗凝藥物，但這類藥物容易誘發血小板癥等副作用[5]，而天然藥物通過多種途徑來發揮藥效，不良反應發生率較小，所以，開發天然、無副作用的抗凝藥物或功能性食品具有非常重要的意義。凝血途徑的篩查指標有凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶原時間（APTT）和凝血酶時間（TT），其中，外源性凝血途徑的篩查指標是PT，內源性凝血途徑的篩查指標是APTT，而TT是用于凝血酶的測定，檢查血漿纖維蛋白原轉變為纖維蛋白能力。APTT和PT可以反映凝血途徑是否正常，所以，通過對凝血酶原時間和活化部分凝血酶原時間的影響來篩選抗凝藥物是抗凝藥物發現的一個重要途徑[6]。研究表明，植物、中藥材中提取的許多天然產物中具有抗凝血的活性，而這些提取物的成分主要是黃酮類化合物、多酚類化合物和多糖[7-10]。同時黃酮類化合物的抗凝血活性和抗血栓作用研究也主要集中在植物和中草藥中。王凱紅等[11]通過測定APTT及相關性分析，初步推斷紅花注射液中體外抗凝血活性物質可能是黃酮類物質。舒盼盼等[12]通過測定PT、APTT，研究人參屬藥材提取物抗凝血活性的差異性。LI等[13]通過測定APTT、PT、TT、FIB，研究月季花中物質的凝血作用。張妲等[14]通過測定全血凝塊溶解率來評價姜黃素類化合物的體外抗血栓作用。目前棗中抗凝血活性研究主要集中在棗多糖，如王娜等[15]對棗中多糖進行抗凝血活性研究，結果表明，大棗粗多糖能顯著延長APTT，而對PT、TT均無明顯影響。棗中黃酮類化合物的研究多集中在抗氧化活性、抗腫瘤方面，對棗中黃酮類化合物體外抗凝血活性和抗血栓作用研究鮮有報道。

本研究通過分析比較油棗中黃酮類化合物的體外抗凝血活性和抗血栓作用，以期為開發相關功能性食品提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

油棗由山西省農業科學院果樹研究所提供；正常人血漿（上海太陽生物科技有限公司）；試驗動物為4個月的新西蘭大白耳，雄性，3 kg，購于北京市昌陽西山養殖場。

PT試劑、APTT試劑：上海太陽生物科技有限公司；CaCl2、KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl：北京化工廠有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；尿激酶：中國食品藥品檢定研究院；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、牛血清白蛋白（BSA）、凝血酶：北京索萊寶科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FREE ZONE真空冷凍干燥機：LABCONCO；CA-50半自動血凝儀：日本Sysmex公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；MS3 D S 25漩渦混勻器：IKA公司；數顯恒溫水浴鍋：國華儀器公司；MILLI-Q超純水儀：Millipore公司

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備將油棗洗凈、晾干、去核后置于真空冷凍干燥箱干燥至恒質量，冷卻后用粉碎機粉碎，過0.25 mm篩后，經超聲輔助提取、大孔樹脂和柱層析分離，最后經半制備液相分離純化得到5種黃酮類化合物，分別為表兒茶素（Epicatechin）、槲皮素（Quercetin）、異槲皮苷（Isoquercitrin）、金絲桃苷（Hyperoside）、蘆?。≧utin）。稱取一定量的黃酮類化合物，加入DMSO，分別配制成20、10、5、2.5、1.25 mg/mL樣 品溶液，過0.45 μm的微孔濾 膜后，進行抗凝血活性研究。DMSO為試劑空白對照組，每個樣品重復3次試驗。稱取一定量的蘆丁，加入5%DMSO，分別配制12.5、25、50 mg/mL樣品溶液，過0.45 μm的微孔濾膜后，進行體外血凝塊溶解率試驗研究。

1.3.2 油棗中黃酮類化合物對PT影響的測定根據張虹等[16]試驗方法進行改進。分別取5份48 μL正常人血漿與2 μL質量濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 mg/mL的5種黃酮類化合物樣品加入到血凝測定杯中，混勻后37℃保溫3 min，取37℃已預熱5～10 min的PT試劑100 μL，加入至待測樣品中，用血凝分析儀測定血漿凝固時間。每個樣品重復3次試驗，試劑空白對照組為2 μL的DMSO。

1.3.3 油棗中黃酮類化合物對APTT影響的測定根據任婧等[17]試驗方法進行改進。分別取5份48 μL正 常 人 血 漿 與2 μL質 量 濃 度 分 別 為1.25、2.5、5、10、20 mg/mL的5種黃酮類化合物樣品加入到血凝測定杯中，混勻后37℃保溫5 min，取37℃已預熱5～10 min的APTT試劑50 μL和37℃已預熱5～10 min的0.025 mol/L CaCl2溶 液50 μL加 入至待測樣品中，用血凝分析儀測定血漿凝固時間。每個樣品重復3次試驗，試劑空白對照組為2 μL的DMSO。

1.3.4 油棗中黃酮類化合物對TT影響的測定配制TT緩沖液：稱取0.6 g Tris、0.2 g NaCl、1 g BSA，加超純水溶解，pH值調至7.5，定容至100 mL。配制TT試劑：用TT緩沖液將1 000 U/mL凝血酶稀釋至5 U/mL，備用。根據WANG等[18]試驗方法進行改進。本試驗分別取5份96 μL正常人血漿與4 μL質量濃度分別為2.5、5、10、20、40 mg/mL的5種黃酮類化合物樣品加入到血凝測定杯中，混勻后，37℃保溫3 min，加50 μLTT試劑，用血凝分析儀測定血漿凝固時間。每個樣品重復3次試驗，試劑空白對照組為4 μL的DMSO。

1.3.5 蘆丁對體外血凝塊溶解率的測定根據張妲等[14]試驗方法，略作修改。動物通過心臟采血后，將兔血置于37℃下放置3 h后凝塊，切成1 cm3左右的血凝塊，用生理鹽水處理干凈。將3個劑量組（12.5、25、50 mg/mL）分別置于試管中，向每個試管中加入1個凝血塊，于37℃水浴中處理4、8、24 h，再稱取血凝塊的質量，計算血凝塊溶解率。每組重復3次，同時做空白對照組和陽性對照組（1 000 U/mL尿激酶）。

式中，W1為初始血凝塊質量，W2為試驗處理后血凝塊質量。

1.4 數據處理

數據經SPSS 20.0進行統計分析，結果中的數據表達為均值±標準差（Mean±SD），結果采用TBtools軟件繪制熱圖，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 油棗中黃酮類化合物對PT的影響

測定正常血漿的PT值為（14.10±0.17）s，試劑空白（DMSO）的PT值為（14.80±0.21）s。將不同質量濃度的5種黃酮類化合物加入到正常血漿中，測定其PT值，結果如圖1所示。將20 mg/mL蘆丁作用到正常血漿，其PT值為（17.80±0.34）s；其次為異槲皮苷，其PT值為（17.60±0.26）s；影響最小的金絲桃苷，其PT值為（16.30±0.05）s。當5種黃酮類化合物作用于正常血漿后，其凝血酶原時間略有延長，但在低質量濃度時幾乎沒有影響。

圖1 黃酮類化合物對PT的影響Fig.1 Effect of flavonoids on PT

2.2 油棗中黃酮類化合物對APTT的影響

測定正常血漿的APTT值為（33.10±0.27）s，試劑空白（DMSO）的APTT值為（35.80±0.35）s。將不同質量濃度的5種黃酮類化合物加入到正常血漿中，測定其APTT值，結果如圖2所示。5種黃酮類化合物作用于正常血漿后，其APTT均有延長，且呈量效關系。其中，蘆丁的抗凝血效果最明顯，當質量濃度為20 mg/mL時，APTT值達（60.80±1.55）s，表 兒 茶 素 作 用 后，APTT值 達（58.70±1.58）s；效果相對差的異槲皮苷在質量濃度為20 mg/mL時，APTT值也達（54.80±1.47）s，5種黃酮類化合物對APTT的影響由高到低依次為蘆?。颈韮翰杷兀鹃纹に兀窘鸾z桃苷＞異槲皮苷。

圖2 黃酮類化合物對APTT的影響Fig.2 Effect of flavonoids on APTT

2.3 油棗中黃酮類化合物對TT的影響

測定正常血漿的TT值為（18.40±0.29）s，試劑空白（DMSO）的TT值為（19.30±0.25）s。將不同質量濃度的5種黃酮類化合物加入到正常血漿中，測定其TT值，結果如圖3所示。將40 mg/mL蘆丁作用到正常血漿，其TT值為（23.90±0.44）s；影響最小的異槲皮苷，其TT值為（21.10±0.48）s。5種黃酮類化合物作用于正常血漿后，低質量濃度時幾乎無影響，當質量濃度為40 mg/mL，蘆丁和表兒茶素對TT的影響最明顯。

圖3 黃酮類化合物對TT的影響Fig.3 Effect of flavonoids on TT

2.4 油棗中黃酮類化合物對動物凝血塊的影響

選取抗凝血效果較為明顯的蘆丁進行動物體外血凝塊溶解率試驗，結果如圖4所示。不同劑量的蘆丁均對血凝塊有溶解作用，且呈量效關系，與空白對照組相比，均差異顯著。高劑量組（50 mg/mL）蘆丁作用于血凝塊4、8、24 h后，測得血凝塊溶解率分別為22.8%、34.2%、41.3%。與尿激酶對照組相比，高劑量組在作用24 h后差距不明顯，但在作用初期（4、8 h）溶解率明顯高于尿激酶處理的血凝塊，且差異顯著。

圖4 蘆丁對動物體外血凝塊溶解率的影響Fig.4 Effect of rutin on dissolution rate of animal blood clot in vitro

3 結論與討論

在預試驗中，比較了DMSO的加入量對PT、APTT、TT的 影 響，結 果 表 明，在 測 定PT和APTT時，加入4 μL的DMSO，就會顯著影響測定結果，加入2 μL的DMSO幾乎不影響測定結果，所以，測定PT和APTT時選用2 μL的測定樣品量；在測定TT時，加入6 μL的DMSO，就會顯著影響測定結果，而加入4 μL的DMSO幾乎不影響測定結果，所以，測定TT時選用4 μL的測定樣品量。

KUNTI?V等[19]研究蘆丁體外抗凝血活性，結果表明，蘆丁可延長APTT，不影響PT和TT結果。李新等[20]通過測定TT、APTT、PT，研究三七粉中活血作用的質量標志物，發現槲皮素可延長APTT。武琦等[21]基于網絡藥理學并結合相關文獻，表明槲皮素可抑制凝血酶、凝血因子活性，阻斷纖維蛋白的形成，還可以提升內皮一氧化氮水平，舒張血管，緩解血栓形成。PT延長通常是由于凝血Ⅰ因子、Ⅱ因子、Ⅴ因子、Ⅶ因子、Ⅹ因子、纖維蛋白原缺乏和血液中抗凝物質存在。APTT延長通常是凝血Ⅷ因子、Ⅸ因子、Ⅺ因子等缺乏以及纖維蛋白溶解活力增強，內源性凝血系統的抑制作用越明顯[22-24]。TT延長通常是血漿纖維蛋白原缺乏、纖溶蛋白溶解系統亢進和血液中存在抗凝物質；TT縮短通常是血液中有鈣離子存在或血液呈酸性等情況引起的[25-26]。內源途徑與外源途徑都不是各自完全獨立，而是互相聯系、互相作用的，外源途徑的TF-FⅦa復合物不僅激活凝血Ⅹ因子，還激活內源途徑的凝血Ⅸ因子，同時凝血Ⅺ因子還可被凝血酶激活；TF-FⅦa復合物活性是體內止血過程啟動的決定性因素[27-29]。

體外抗凝血試驗結果表明，油棗中黃酮類化合物主要影響APTT的測定結果，APTT延長時間越長，內源性凝血系統的抑制作用越明顯。說明油棗中黃酮類化合物具有體外抗凝血活性，而且主要通過影響內源性凝血系統發揮作用。其原因可能是由于黃酮類化合物對凝血Ⅷ因子、Ⅸ因子、Ⅺ因子或Ⅻ因子的影響造成的，具體機理還有待進一步研究。體外血凝塊溶解率試驗結果表明，不同劑量的蘆丁均可使動物體外血凝塊溶解，說明油棗中黃酮類化合物具有抑制血栓形成的作用，推測可能是黃酮類化合物引起的纖溶蛋白溶解系統的激活作用，但對抗血栓作用機理還有待進一步研究。