青稞不同組分蛋白提取方法比較研究

鄧 婷，黨 斌，張文剛，遲 明， 楊希娟

（1.青海大學農林科學院/青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，青海西寧 810016；2.青藏高原種質資源研究與利用實驗室，青海西寧 810016；3.青海省輕工業研究所有限公司，青海西寧 810001）

青稞是禾本科大麥屬大麥栽培的變種，俗稱裸大麥[1]，是青藏高原特有農作物，生長在海拔4 000 多m的青藏高原，是我國高寒農業區主要糧食作物，也是藏族群眾賴以生存的基本口糧[2-4]。青稞相比一般谷物具有“三高兩低”的獨特優勢（如高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖），且富含β -葡聚糖、多酚、淀粉等活性成分[5-7]。目前，青稞營養組分的研究多關注淀粉[8]、β -葡聚糖[9]、多酚[10]等活性成分，對于青稞蛋白的研究相對較少。

青稞中蛋白質含量較高，氨基酸配比合理，蛋白質平均含量約13.08%[11]，是水稻的2 倍，是高粱和玉米的1.5 倍[12]，極具有開發利用價值。目前，關于青稞蛋白的研究主要集中于青稞分離蛋白的提取工藝優化及功能性質研究[13-14]、蛋白酶解多肽的制備[15]等方面，而關于青稞組分蛋白的研究較少。根據溶解度的不同，青稞蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白4 種組分。已有研究報道了不同品種青稞中4 種組分蛋白的含量[16]，但是其提取方法均是按照小麥組分蛋白的方法進行的。雖然青稞和小麥中均含有以上4 種蛋白組分，但是其含量、分子量大小存在明顯差異[17]。因此，優化比較傳統Osborne 提取方法與超聲波法提取青稞中組分蛋白的工藝，旨在探尋一種適合青稞中組分蛋白的提取方法。以期為青稞品質的功能評價提供理論依據，同時為青稞蛋白的深度開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青稞（西寧昆侖15 號），青海省農林科學院作物所提供。

無水乙醇、磷酸、過硫酸銨，均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供；考馬斯亮藍（G250、R250）、牛血清蛋白、電泳制膠液、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、甘氨酸、四甲基乙二胺（TEMED）、蛋白Marker（11-245 kDa）均為生化試劑，北京索萊寶科技有限公司提供。

1.1.2 主要儀器設備

AL204 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產品；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司產品；DL-5M 型低速冷凍離心機，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司產品；N4S 型紫外線可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；DYY-6D 型電腦三恒多用電泳儀電源、DYCZ-30C 型電泳儀，北京市六一儀器廠產品；PD-A 型X線膠片觀察燈，汕頭市粵華醫療器械廠有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 組分蛋白提取率的測定

采用考馬斯亮藍法（G250 顯色法）測定蛋白質質量濃度[18]，以吸光度A 為縱坐標（Y），牛血清蛋白標準液質量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），繪制蛋白質標準曲線，建立回歸方程為Y=5.74X+0.019 3（R2=0.998 3）。按以下公式計算組分蛋白提取率：

式中：X——蛋白提取率，%；

C——提取液蛋白溶液質量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m—樣品中蛋白含量，g。

1.2.2 傳統Osborne 法提取青稞各組分蛋白

（1）提取流程。青稞全籽粒粉碎后即為試驗樣品。準確稱取2 g 樣品于50 mL 離心管中，按設定的料液比加入去離子水，攪拌均勻，在一定溫度下，恒溫水浴振蕩浸提，以轉速4 000 r/min 離心20 min得到上清液A 和殘渣A，收集上清液A，即為清蛋白提取液；殘渣A 中加入NaCl 溶液，重復上述提取步驟，得到上清液B 和殘渣B，收集上清液B，即為球蛋白提取液；依次向殘渣B 中加入乙醇溶液，提取醇溶蛋白，即得到上清液C 和殘渣C，再向殘渣C中加入NaOH 溶液提取谷蛋白，重復上述操作即得上清液D 和殘渣D；按照1.2.1 所述方法計算各組分蛋白提取率。

（2）正交試驗方法。在單因素試驗結果基礎上，以蛋白提取率為指標，選取提取劑質量分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為因素，設計L9（34）正交試驗。

傳統Osborne 法提取組分蛋白正交試驗因素與水平見表1。

表1 傳統Osborne 法提取組分蛋白正交試驗因素與水平

1.2.3 超聲波提取青稞各組分蛋白工藝

（1）提取流程。準確稱取2 g 樣品于50 mL 離心管中，按料液比1∶16 加入去離子水，攪拌均勻，設置超聲波清洗機功率250 W，溫度50 ℃，浸提30 min后，以轉速4 000 r/min 離心20 min，上清液即為清蛋白提取液；再向提取過清蛋白的殘渣中按料液比1∶14 加入5% NaCl 溶液，在超聲功率300 W，溫度30 ℃，超聲時間40 min 條件下提取并離心得球蛋白提取液；依次向球蛋白提取液殘渣中加入65%乙醇溶液，在料液比1∶12，超聲功率300 W，溫度35 ℃，超聲時間50 min 條件下提取并離心得到醇溶蛋白提取液；再向提取過醇溶蛋白的殘渣中按料液比1∶16加入質量分數為0.25%的NaOH 溶液，在超聲功率450 W，溫度55 ℃，超聲時間45 min 條件下提取并離心得谷蛋白提取液。

（2）正交試驗方法。以蛋白提取率為指標，選取料液比（A'）、超聲功率（B'）、提取溫度（C'）、超聲時間（D'）為因素，固定NaCl 質量分數為5%，乙醇體積分數為65%，NaOH 質量分數為0.25%，設計L9（34）水平正交試驗。

超聲波提取組分蛋白正交試驗因素與水平見表2。

表2 超聲波提取組分蛋白正交試驗因素與水平

1.2.4 組分蛋白等電點測定

參考孫媛等人[19]的方法，將提取的青稞各組分蛋白上清液，等量分別取7 份各5 mL 上清液于10 mL離心管中，用濃度0.1 mol/L HCl 溶液或0.1 mol/L NaOH 溶液調節pH 值至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，靜置離心后取上清液，用考馬斯亮藍法測樣品于波長595 nm 處的吸光度，吸光度越小，說明上清液中蛋白質含量越低，對應的pH 值即為等電點。

1.2.5 青稞組分蛋白分子量分布的SDS-PAGE 凝膠電泳分析

參考張文剛等人[20]的方法稍作調整，采用蛋白質凝膠電泳（SDS-PAGE）來分析青稞不同組分蛋白的分子量分布。分離膠質量分數為12%，濃縮膠為4%，取40 μL 青稞組分蛋白提取液加入160 μL 上樣緩沖液（變性電泳組含5%巰基乙醇），沸水浴5 min。取15 μL 處理后的樣品上樣后進行電泳，電泳結束后將分離凝膠置于含有0.25%考馬斯亮藍R-250 的染色液中染色1 h，再用含有甲醇-乙酸的水溶液進行脫色，在X 線膠片觀察燈下觀察條帶。

1.2.6 數據處理

所有試驗均重復3 次，采用SPSS 26.0 軟件進行正交試驗設計與分析，運用Excel 和Origin 2019b 軟件進行數據統計分析及繪圖。

2 結果和分析

2.1 正交試驗結果及分析

2.1.1 傳統Osborne 法提取青稞組分蛋白正交試驗設計及結果

（1）清蛋白提取工藝參數正交試驗結果。

清蛋白提取正交試驗結果見表3，清蛋白提取方差分析見表4。

表3 清蛋白提取正交試驗結果

表4 清蛋白提取方差分析

由表3 可知，各因素對清蛋白Osborne 法提取率的影響依次為提取溫度＞料液比＞提取時間，最優組合為A3B3C3。由表4 可知，提取溫度為顯著因素，料液比和提取時間對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為料液比1∶14，提取溫度55 ℃，提取時間80 min。在該最優條件下提取率達到41.79%，高于正交試驗中所有組合。

（2）球蛋白提取工藝參數正交試驗結果。

球蛋白提取正交試驗結果見表5，球蛋白提取方差分析見表6。

由表5 可知，各因素對球蛋白傳統Osborne 法提取率的影響依次為料液比＞提取時間＞提取溫度＞NaCl 質量分數，最優組合為A1B3C3D3。由表6 可知，提取時間和料液比為顯著因素，NaCl 質量分數和提取溫度對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為料液比1∶14，提取時間80 min，提取溫度45 ℃，NaCl 質量分數5%，此最優條件下球蛋白提取率達到36.72%。

表5 球蛋白提取正交試驗結果

表6 球蛋白提取方差分析

（3）醇溶蛋白提取最佳工藝參數正交試驗結果。

醇溶蛋白提取工藝參數正交試驗見表7，醇溶蛋白提取方差分析見表8。

表7 醇溶蛋白提取工藝參數正交試驗

表8 醇溶蛋白提取方差分析

由表7 可知，各因素對醇溶蛋白傳統Osborne 法提取率的影響依次為提取溫度＞乙醇體積分數＞料液比＞提取時間，最優組合為A1B3C3D3。由表8 可知，提取溫度和乙醇體積分數為顯著因素，料液比和提取時間對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為乙醇體積分數65%，料液比1∶12，提取溫度45 ℃，提取時間80 min，此最優條件下醇溶蛋白提取率達到25.81%。

（4）谷蛋白提取最佳工藝參數正交試驗結果。

谷蛋白提取工藝參數正交試驗見表9，谷蛋白提取方差分析見表10。

表9 谷蛋白提取工藝參數正交試驗

表10 谷蛋白提取方差分析

由表9 可知，各因素對谷蛋白傳統Osborne 法提取率的影響依次為料液比＞NaOH 質量分數＞提取溫度＞提取時間，最優組合為A2B3C3D2。由表10 方差分析可知，NaOH 質量分數和料液比為顯著因素，提取溫度和提取時間對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為料液比1∶16，NaOH 質量分數0.25%，提取溫度65 ℃，提取時間120 min，在此最優條件下提取率達到89.21%。

2.1.2 超聲波提取青稞組分蛋白正交試驗設計及結果

（1）清蛋白提取工藝參數正交試驗結果。

清蛋白提取工藝參數正交試驗見表11，清蛋白提取方差分析見表12。

由表11 可知，各因素對清蛋白超聲法提取率的影響為料液比＞提取溫度＞超聲時間＞超聲功率，最優組合為由表12 可知，料液比為顯著因素，超聲功率、提取溫度、超聲時間對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為料液比1∶14，提取溫度50 ℃，超聲時間30 min，超聲功率250 W，在此最優條件下提取率達到60.13%。

表11 清蛋白提取工藝參數正交試驗

表12 清蛋白提取方差分析

（2）球蛋白提取工藝參數正交試驗結果。

球蛋白提取工藝參數正交試驗見表13，球蛋白提取方差分析見表14。

表13 球蛋白提取工藝參數正交試驗

表14 球蛋白提取方差分析

由表13 可知，各因素對球蛋白超聲法提取率的影響依次為超聲功率＞提取溫度＞超聲時間＞料液比，最優組合為A''2B''2C''1D''2。由表14 可知，超聲功率、提取溫度為顯著因素，料液比和超聲時間對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為料液比1∶14，超聲功率300 W，提取溫度25 ℃，超聲時間40 min，在此最優條件下提取率達到49.82%。

（3）醇溶蛋白提取工藝參數正交試驗結果。

醇溶蛋白提取工藝參數正交試驗見表15，醇溶蛋白提取方差分析見表16。

表15 醇溶蛋白提取工藝參數正交試驗

表16 醇溶蛋白提取方差分析

由表15 可知，各因素對醇溶蛋白超聲法提取率的影響依次為料液比＞提取溫度＞超聲功率＞超聲時間，最優組合為A'''3B'''1C'''3D'''1。由表16 方差分析可知，料液比和提取溫度為顯著因素，超聲功率和超聲時間對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為料液比1∶14，超聲功率300 W，提取溫度35 ℃，超聲時間45 min，在此最優條件下提取率達到48.18%。

（4）谷蛋白提取工藝參數正交試驗結果。

谷蛋白提取工藝參數正交試驗見表17，谷蛋白提取方差分析見表18。

由表17 可知，各因素對谷蛋白超聲法提取率的影響依次為料液比＞超聲功率＞提取溫度＞超聲時間，最優組合為A''''3B''''3C''''3D''''2。由表18 可知，料液比為顯著因素，超聲功率、提取溫度、超聲時間對提取率的影響不顯著。最佳工藝參數為料液比1∶16，超聲功率450 W，提取溫度55 ℃，超聲時間40 min，在此最優條件下提取率達到97.63%。

表17 谷蛋白提取工藝參數正交試驗

表18 谷蛋白提取方差分析

2.2 青稞組分蛋白等電點測定結果

青稞組分蛋白等電點見圖1。

由圖1 可知，4 種青稞蛋白質在不同pH 值下的吸光度存在差異。醇溶蛋白和谷蛋白在pH 值2.0～4.0 吸光度呈下降趨勢，而清蛋白和球蛋白吸光度在該pH 值范圍內有所波動且總體變化相反，當pH 值高于4.0 后4 種青稞蛋白質的吸光度均有明顯增大趨勢，上述結果與孫媛[21]關于小麥4 種蛋白分離分級的報道相類似。當pH 值分別為2.5，3.5，4.0 和4.0 時清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白溶液吸光度最小，各蛋白質形成的沉淀最多，推測上述pH 值即為青稞不同組分蛋白的等電點。溶液中蛋白質以兩親性離子形式存在，在遠離等電點時蛋白顆粒帶同種電荷較多，顆粒之間靜電斥力強，不易聚集沉淀，溶解度較高；但在等電點附近時，蛋白質顆粒凈電荷趨于0，顆粒之間相互作用力小，易于聚集沉淀，導致溶解度顯著降低。

圖1 青稞組分蛋白等電點

2.3 2 種提取方法蛋白提取率比較及SDS-PAGE 電泳圖譜

2.3.1 2 種提取方法蛋白提取率比較

2 種提取方法不同組分蛋白提取率比較見表19。

表19 2 種提取方法不同組分蛋白提取率比較

由表19 可知，超聲波提取能顯著提高青稞不同組分蛋白的提取率，相比傳統Osborne 提取法而言，提取率分別提高了約19.94%（清蛋白），11.81%（球蛋白），16.6%（醇溶蛋白），7.92%（谷蛋白），且極大縮短了各組分蛋白的提取時間，其中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白提取時間分別縮短了50，40，30，75 min。李茉等人[22]采用超聲波法提取辣椒籽蛋白，與傳統提取法相比蛋白提取量增加了0.81 g/100 g；張兆云等人[23]采用超聲波輔助 提取藜麥清蛋白，發現提取率增大至40.1%，即超聲處理可以有效提高蛋白提取率，與試驗結果基本一致。Ahmed Taha 等人[24]研究了超聲波提取對核桃不同組分蛋白提取率和理化性質的影響，發現超聲波極大地提高了核桃組分蛋白提取率并有效改善其功能性質。超聲波的強烈振動、空化效應和攪拌作用可以破壞植物的細胞，使細胞內蛋白質的溶出速率和溶出量增大，從而顯著提升植物蛋白的提取效率。

2.3.2 青稞不同組分蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜

不同提取方法下青稞組分蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜見圖2。

圖2 不同提取方法下青稞組分蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜

由圖2 可知，4 種蛋白的亞基分布主要集中在11～75 kDa。清蛋白亞基主要集中在11～66 kDa；球蛋白主要集中在12～63 kDa；醇溶蛋白條帶細少，主要分布在32～55 kDa 和小于15 kDa；谷蛋白亞基條帶最少，主要分布在37～50 kDa 和70 kDa。超聲提取青稞蛋白的條帶清晰且各亞基分離較好，說明所得蛋白含量和純度相對較高[25]。2 種提取方法下蛋白的亞基數量和含量有明顯差別，超聲法提取的各蛋白亞基條帶均多于傳統Osborne 法。相較而言，傳統Osborne 法提取的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別在分子量30～48 kDa，28～32 kDa，30 kDa 和35～48 kDa/75 kDa 存在條帶缺失。在分子量低于40 kDa區域，傳統Osborne 法所得蛋白亞基條帶較少，可能原因是水浴提取所需的溫度較高，蛋白存在一定程度的損失和降解，同時該區域蛋白亞基條帶顏色淺且模糊，可能是隨著提取時間的延長，蛋白質和小分子等活性物質發生了相互作用[26]。張舒等人[27]通過2 種不同處理提取出綠豆蛋白，經SDS-PAGE 分析發現，隨著熱處理時間的延長，綠豆蛋白亞基條帶均變淺，且有不同分子質量的亞基條帶逐漸消失，這與本試驗結果相類似。綜上，超聲波法提取蛋白的含量更高且組成更豐富，可以更好地分離出青稞高分量組分蛋白。

3 結論

優化了傳統Osborne 法和超聲波法提取青稞4 種蛋白的工藝，并比較了2 種方法的提取性能。在最佳條件下，2 種方法均能有效提取青稞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，且4 種蛋白的等電點分別為2.5，3.5，4.0，pH 值4.0。超聲波提取法制備的不同蛋白含量和純度更高、組成更豐富，包含的大分子量蛋白更多。相比傳統Osborne 提取法，超聲提取法可以顯著提升蛋白的提取效率，縮短提取時間，可作為青稞組分蛋白的良好提取技術。比較分析了青稞蛋白的2 種提取工藝，對2 種方法下不同組分蛋白的理化和功能特性還需進一步探討，以期為青稞蛋白質的高效分離制備與應用提供理論支撐。