不同干燥方式對(duì)石榴皮單寧提取液抑菌效果的研究

李 敏，曾宇玲，錢玉梅，趙 芳

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

石榴（Punica granatum）為桃金娘科番石榴屬落葉灌木或小喬木植物。早在西漢劉歆撰寫《西京雜記》記載“安石榴楟十株”，因此又稱安石榴，由原產(chǎn)地中亞地區(qū)阿富汗等國(guó)經(jīng)絲綢之路引種至中國(guó)，迄今已有2 000 多年的栽培歷史。石榴樹對(duì)栽培環(huán)境要求低和易管理等優(yōu)點(diǎn)，促使其在我國(guó)各地均有種植，尤其安徽、江蘇和河南等省，產(chǎn)地以豐富種質(zhì)資源、高品質(zhì)和產(chǎn)量聞名國(guó)內(nèi)外。石榴果實(shí)外觀鮮艷，其果肉富含維C、多酚、黃酮和花青素類等營(yíng)養(yǎng)成分且風(fēng)味酸甜爽口，再加上民間寓意吉祥，廣受消費(fèi)者喜愛[1]。通常人們僅取果肉食用，而將占石榴果實(shí)20%～30%的果皮部位作為廢棄物扔掉，使石榴資源得不到充分利用，浪費(fèi)了石榴中的有效成分。大量研究表明，石榴皮中富含多酚、多糖、有機(jī)酸和微量元素等化學(xué)物質(zhì)[2-3]，這些物質(zhì)賦予其抑菌、抗氧化和抗腫瘤活性，是石榴藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[4-5]。

近年來(lái)，石榴皮中的單寧作為一種可再生的天然多酚類聚合物，其含量、功能及應(yīng)用的研究逐漸受到人們的重視，如通過(guò)抑制DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制真菌感染，可以作為除藻劑用于海水凈化，也可以作為潛在的釀酒單寧應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)中[6-9]。曲繼鵬等人[10]研究表明，不同干燥處理方式影響石榴皮中生物活性物質(zhì)的抑菌效果。然而，有關(guān)不同干燥處理方式對(duì)石榴皮提取液?jiǎn)螌幒考捌湟志Ч挠绊懳匆妶?bào)道。以安徽懷遠(yuǎn)石榴皮為材料，對(duì)3 種干燥方式預(yù)處理石榴皮提取液中單寧含量及其抑菌效果進(jìn)行研究，將為石榴皮進(jìn)一步開發(fā)和研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和預(yù)處理

從安徽懷遠(yuǎn)石榴園中購(gòu)置市售常見“白花玉石籽”石榴，挑選果皮無(wú)損傷和無(wú)疤痕新鮮優(yōu)果。將石榴果皮剝下后分別置于室外陽(yáng)光下（自然曬干）、50 ℃恒溫干燥烘箱（恒溫烘干）和微波爐中（微波干燥）調(diào)節(jié)溫度進(jìn)行干燥處理，以上3 種處理方式均將石榴果皮干燥達(dá)到恒質(zhì)量。

1.2 試劑與器材

試劑：試劑主要為丙酮，國(guó)藥試劑提供；氯化銨，國(guó)藥試劑提供；乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2），為分析純。

儀器：自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器、高速多功能粉碎機(jī)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、微波爐等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 石榴皮單寧提取物的制備

采用高速多功能粉碎機(jī)將干燥的石榴皮粉碎，收集過(guò)60 目篩的石榴皮粉末用于單寧的提取。參照任平等人[11]研究方法對(duì)石榴皮單寧進(jìn)行提取。具體操作如下：稱取石榴皮粉末0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，按照料液比為1∶20 加入60%丙酮溶液，并將圓底燒瓶置于80 ℃水浴鍋中浸提，期間進(jìn)行多次振蕩。浸提3 h 后取出圓底燒瓶室溫放置冷卻，后置于離心管中，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min，取上清液，殘?jiān)凑找陨喜襟E重復(fù)提取2 次，最后合并上清液為石榴皮單寧提取液。以上均做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 石榴皮單寧提取液含量的測(cè)定

參考舒楊雄等人[12]研究方法測(cè)定石榴皮中單寧的含量。具體操作如下：將石榴皮單寧提取液置于25 mL 刻度試管中，并于35 ℃恒溫水浴加熱。另外，取濃度為1 mol/L 的乙酸鋅溶液1 mL 和飽和氨水溶液0.7 mL 加入錐形瓶中進(jìn)行搖勻，一直搖至白色溶液全部溶解后進(jìn)行冷卻濾過(guò)。然后取濾液1 mL置于錐形瓶中，加入NH4Cl-NH3·H2O 緩沖液1.25 mL（pH 值10）、鉻黑T 指示劑溶液0.05 mL 和蒸餾水15 mL，再以0.005 mol/L 的EDTA（Na2）標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)即為滴定終點(diǎn)。按照以下公式進(jìn)行計(jì)算。

式中：0.155 6——試驗(yàn)所得的比例常數(shù)；

V——1 mol/L 醋酸鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液的絡(luò)合沉淀消耗量，mL；

M——樣品質(zhì)量，g。

以上均做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 石榴皮單寧提取液抑菌效果的研究

（1）供試菌株來(lái)源及活化。試驗(yàn)使用2 種菌株即大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus），均由宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)在供試菌種的斜面上輕挑單個(gè)菌落置于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，然后放入搖床恒溫37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

（2）石榴皮單寧提取液的抑菌效果研究。采用牛津杯法研究石榴皮單寧提取液的抑菌效果，具體操作如下：用牛津杯法進(jìn)行抑菌效果的測(cè)定。用無(wú)菌鑷子夾取已滅菌烘干的牛津杯，放置到已涂布菌液的培養(yǎng)皿表面，分別向每個(gè)牛津杯里加入0.2 mL不同單寧質(zhì)量濃度（4.28，2.14，1.07，0.54，0.27，0.14 mg/mL）石榴皮提取溶液，用60%丙酮溶液為對(duì)照。每組做3 個(gè)平行，每個(gè)培養(yǎng)皿里放3 個(gè)牛津杯。置于37 ℃恒溫下培養(yǎng)24 h 后，用直尺測(cè)量抑菌圈大小，重復(fù)試驗(yàn)3 次，取平均值，扣除對(duì)照抑菌圈值，以菌落形成的最小單寧濃度為最小抑菌濃度（MIC），用MIC 判斷抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對(duì)石榴皮外觀的影響

分別用自然曬干、烘箱烘干和微波烘干3 種方式對(duì)石榴皮進(jìn)行干燥處理。

不同干燥方式對(duì)石榴皮外觀的影響見圖1。

圖1 不同干燥方式對(duì)石榴皮外觀的影響

由圖1 可知，石榴皮經(jīng)自然曬干，顏色較淺，整體褐化程度較低；經(jīng)鼓風(fēng)干燥箱烘干的石榴皮，顏色很深，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重；經(jīng)微波烘干的石榴皮，顏色較深，雖褐化現(xiàn)象不嚴(yán)重，但出現(xiàn)石榴皮焦化現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明，石榴皮在自然曬干下對(duì)外觀影響最小，褐化程度最低。

2.2 不同干燥方式對(duì)石榴皮提取液中單寧含量的影響

采用60%丙酮作為提取溶劑，分別對(duì)自然曬干、烘箱烘干、微波烘干的干燥方式獲得的石榴皮粉末進(jìn)行浸漬提取，提取時(shí)間3 h。

不同加工方式對(duì)石榴皮中單寧含量的測(cè)定見表1。

由表1 可知，3 種不同的干燥方式對(duì)石榴皮中單寧的提取效果有所不同，在自然曬干條件下，單寧提取含量最高，為21.37%；其次為鼓風(fēng)干燥箱烘干加工方式，提取單寧含量為20.88%；微波烘干條件下提取單寧含量最低，為19.73%。

表1 不同加工方式對(duì)石榴皮中單寧含量的測(cè)定 /%

2.3 不同干燥方式的石榴皮中單寧提取液抑菌效果的研究

試驗(yàn)采用MIC 值判斷不同干燥方式條件下，石榴皮中單寧提取液抑菌的效果。

不同干燥方式的石榴皮中單寧提取液抑菌效果的研究見表2。

表2 不同干燥方式的石榴皮中單寧提取液抑菌效果的研究 /mg·mL-1

由表2 可知，3 種干燥方式預(yù)處理石榴皮中的單寧提取液對(duì)S.aureus（革蘭氏陽(yáng)性菌G+）的抑菌MIC 值均為0.27 mg/mL，對(duì)大腸桿菌E.coli 抑菌MIC 值為1.07 mg/mL，可以判斷石榴皮單寧提取液對(duì)S.aureus 的抑菌效果顯著高于E.coli；對(duì)于同種菌株，3 種干燥方式預(yù)處理石榴皮的單寧提取液抑菌效果無(wú)明顯差異。

3 結(jié)論

安徽懷遠(yuǎn)地區(qū)產(chǎn)的石榴以品種優(yōu)良聞名國(guó)內(nèi)外，被列為國(guó)家地理標(biāo)志性產(chǎn)品。隨著生活水平的提高，人們對(duì)石榴果實(shí)消費(fèi)量逐年增加，急需對(duì)廢棄的石榴皮功能性物質(zhì)采取有效手段進(jìn)行開發(fā)與應(yīng)用，以解決資源利用不充分的問題。研究結(jié)果表明，石榴皮中單寧的含量較高，與烘箱烘干和微波烘干比較，自然曬干對(duì)石榴皮外觀影響較小且單寧提取含量最高（21.37%±0.02%）；3 種干燥處理石榴皮單寧提取液對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）抑制效果明顯優(yōu)于對(duì)大腸桿菌（E.coli）抑制效果，且抑制效果不受干燥方式的影響。因此，可以采用自然曬干方式對(duì)石榴皮進(jìn)行干燥，且有利于石榴皮單寧提取。