基于QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法檢測八角中莽草毒素的研究

鐘玉心，王 宇，錢振杰，陳彥宏，張 輝，王 偉，何詠欣，楊嘉鑫威，龔海錕，徐振林

（1．華南農業大學 食品學院 廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510640；2．廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511405；3．黃埔海關技術中心，廣東 廣州 510700）

八角（Illicium verum Hook.f），也稱八角茴香（Illicium verum），為八角屬八角種植物，其種植歷史悠久，用途廣泛，在亞洲地區常用作烹飪調料［1］，因具有鎮痛和鎮靜功能，通常被當作中藥用于治療嘔吐、胃痛［2］。同屬多種植物如莽草、野八角、日本莽草與八角形態相似，但均含有莽草毒素（Anisatin）（結構式見圖1），因此具有不同程度的毒性，誤用會引起中毒［3］。莽草毒素屬于倍半萜內酯神經毒素，其半數致死量（LD50）為0．76 mg/kg［4］。在歐美地區，因飲用混淆或摻假了日本莽草（Illicium anisatum L.）的八角茴香茶引起的中毒事件時有報道［5］。在中國也發生過誤服莽草而導致的中毒事件［6］。由于八角與其偽品莽草等同科植物的外觀形態非常相似，僅從完整干果外觀難以將其準確區分；對于缺乏形態特征的八角茴香粉，更無法通過外形鑒別真偽，導致八角產品易因原料誤摻莽草而引發中毒事件。因此，建立一種準確的八角摻偽鑒別和質量控制方法顯得尤為重要。

圖1 莽草毒素化學結構式Fig．1 Chemical structure of anisatin

目前，已有研究報道八角茴香及其偽品的鑒別方法，如采用形態學分析方法，通過熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡對八角及其偽品進行顯微結構鑒別［4，7］；采用頂空固相萃取-氣相色譜-質譜法比較八角茴香及其偽品中的揮發性風味成分種類與含量的差異［6］；基于八角茴香與偽品在毒性成分莽草毒素含量上的差異［8］，采用高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）對引起中毒的特征成分莽草毒素進行定量分析［4］。其中，HPLC-MS/MS是最常用的八角偽品毒性成分檢測方法，可在中毒事故發生后早診斷早干預，降低莽草毒素中毒的死亡率。目前中國藥典僅規定了八角中反式茴香腦的含量［9］，而對莽草毒素尚未指定標準檢測方法。現有的HPLC-MS/MS法主要采用液液萃取、固相萃取的前處理方式，耗時較長。QuEChERS前處理技術具有快速、簡單、廉價、高效、安全的優點，已廣泛應用于農藥殘留分析，在生物毒素領域也開始得到應用［10］。本文基于QuEChERS前處理方法，建立了八角中莽草毒素的HPLC-MS/MS檢測方法，并用于市售八角茴香中莽草毒素含量的檢測。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

莽草毒素標準品（CAS：5230-87-5，純度97．4%）、甲酸（色譜純）（美國Sigma Aldrich公司）；甲醇、乙腈（LC/MS級，美國Thermo公司）；乙酸（色譜純，天津科密歐化學試劑公司）；QuEChERS鹽包（4．0 g無水硫酸鎂，1．0 g氯化鈉）、乙酸緩沖鹽萃取鹽包（6．0 g無水硫酸鎂，1．5 g乙酸鈉）、檸檬酸緩沖鹽萃取鹽包（4．0 g無水硫酸鎂，1．0 g氯化鈉，1．0 g二水合檸檬酸鈉，0．5 g檸檬酸氫二鈉）均購于美國Agilent公司；N-丙基乙二胺（PSA）、C18和石墨化碳黑（GCB）均購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

實驗所用八角樣品均為市售。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜儀（AB Sciex 5500 QTRAP，美國AB SCIEX公司）；電子天平（CP225D，德國Sartorius公司）；Milli-Q Academic超純水系統（德國Millipore公司）；高速冷凍離心機（Sorvall ST 16R，美國Thermo公司）；多位點渦旋振蕩器（Multi Reax，德國Heidolph公司）；圓周振蕩器（MA 3 basic，德國IKA公司）；Accucore aQ C18色譜柱（2．1 mm×150 mm，2．6 μm，美國Thermo公司）。

1.3 標準溶液的配制

莽草毒素標準儲備液（1．0 mg/mL）：準確稱取莽草毒素標準品10 mg（精確至0．01 mg），以甲醇溶解后，轉移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，于-20℃保存。

莽草毒素標準中間液（1．0 μg/mL）：準確吸取100 μL莽草毒素標準儲備液至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，于-20℃保存。

莽草毒素標準工作液：分別移取適量莽草毒素標準中間液，用乙腈稀釋定容，配制成1．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0 ng/mL的標準工作液，現用現配。

1.4 樣品前處理

稱取0．5 g樣品（精確至0．01 g）至50 mL具塞離心管中，加入1顆陶瓷均質子、5 mL超純水、10 mL乙腈，渦旋提取10 min，加入乙酸緩沖鹽萃取鹽包，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min，以8 000 r/min離心3 min。吸取2 mL上清液至QuEChERS樣品凈化管中（內含200 mg PSA、50 mg GCB），渦旋1 min，以8 000 r/min離心3 min，過0．22 μm有機微孔濾膜，供HPLC-MS/MS檢測。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：Accucore aQ C18柱（2．1 mm×150 mm，2．6 μm）；流動相：A為甲醇，B為含0．1%甲酸的水溶液；流速：0．3 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：40℃；梯度洗脫程序：0~4．0 min，95% B；4．0~7．0 min，95%~20% B；7．0~9．0 min，20% B；9．0~9．1 min，20%~95% B；9．1~12．0 min，95%B。

1.5.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源；離子掃描模式：負離子模式（ESI-）；掃描方式：多反應監測（MRM）模式；離子源溫度：500℃；氣簾氣：206．8 kPa（30 psi）；離子化電壓：4 500 V；碰撞氣：55．2 kPa（8 psi）；輔助加熱器1（GS1）：344．7 kPa（50 psi）；輔助加熱器2（GS2）：344．7 kPa（50 psi）。

1.6 數據處理

采用AB Sciex Analyst Software軟件進行數據采集，Multi Quant（3．0．2）軟件處理數據，Origin 2019b軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

以甲醇-水（1∶1）為溶劑，配制100 ng/mL的莽草毒素標準溶液，注入質譜系統，進行正負離子掃描，篩選母離子。結果表明：負離子模式下分子離子［M-H］-（m/z327．1）的響應值最高。在-5~-50 eV范圍內逐步改變碰撞能量，直至母離子強度為基峰強度的1/3，篩選出m/z297．1、126．9的子離子，組建MRM離子對，并優化去簇電壓及碰撞能量。質譜參數見表1。

表1 莽草毒素質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for anisatin

2.2 流動相優化

考察了普通C18色譜柱和aQ柱對莽草毒素的分離效果，結果表明，兩者均可對莽草毒素進行測定，但不同色譜柱上的峰形差別較大。莽草毒素在aQ色譜柱上的峰形尖銳，分離效果好，故選擇aQ柱作為分析柱。考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0．1%甲酸水溶液作為流動相的效果。結果表明，以乙腈-水為流動相的分離效果較差，存在峰重疊現象，調節梯度洗脫程序也無法得到滿意的分離效果；而甲醇極性弱于乙腈，能實現目標化合物和雜質的分離；加入0．1%甲酸雖抑制了莽草毒素電離導致響應有所降低，但可減少基質效應的影響。故選擇甲醇-0．1%甲酸水溶液為流動相。在優化洗脫程序下，莽草毒素標準溶液與加標樣品的色譜圖見圖2。

圖2 莽草毒素標準溶液（A）與加標樣品（B）的色譜圖Fig．2 Chromatograms of anisatin standard solution（A）and a spiked sample（B）

2.3 樣品前處理方法優化

2.3.1 提取溶劑的選擇QuEChERS常用的提取溶劑為甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等。相較于其它提取溶劑，乙腈具有很好的破壁作用及無機鹽鹽析作用，加入無機鹽可使乙腈與水相分層，提高提取效率［11-12］。本實驗首先考察了乙腈為提取溶劑時的提取效率；同時考察了加入1%乙酸對提取效果的影響。結果顯示，乙腈的提取率達97%，而1%乙酸的加入對提取率的影響不明顯，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 緩沖鹽體系的選擇本實驗比較了普通QuEChERS鹽包（1．0 g氯化鈉，4．0 g無水硫酸鎂）、乙酸緩沖鹽萃取鹽包（6．0 g無水硫酸鎂，1．5 g乙酸鈉）、檸檬酸緩沖鹽萃取鹽包（4．0 g無水硫酸鎂，1．0 g氯化鈉，1．0 g二水合檸檬酸鈉，0．5 g檸檬酸氫二鈉）、氯化鈉對提取效果的影響。結果表明，使用普通QuEChERS鹽包及氯化鈉作為鹽析劑時，回收率分別為92．9%及94．4%；使用檸檬酸緩沖鹽萃取鹽包的回收率最低，僅為77．7%；而使用乙酸緩沖鹽萃取鹽包的回收率可達98．0%。因此本實驗采用乙酸緩沖鹽萃取體系。

2.3.3 凈化劑及其用量的選擇八角中含有大量的反式茴香醚及莽草酸［13］，必須進行凈化，避免雜質干擾檢測、污染質譜系統。QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB［12］。PSA可以消除樣品中的有機酸、色素、糖類、脂肪酸等雜質［14］，C18可去除油脂和弱極性雜質［15-16］，GCB可去除色素及平面結構物質［17-18］。因此，考察了上述3種凈化劑對莽草毒素回收率的影響（圖3）。結果顯示，C18對莽草毒素的吸附作用最大，其平均回收率僅為64%；而隨著PSA用量的增加，莽草毒素的回收率不斷提高，PSA用量為200 mg時與500 mg的回收率相近，因此選擇200 mg PSA作為凈化劑；GCB雖對莽草毒素有一定的吸附，但其對色素的凈化效果較佳，經GCB凈化后的提取液最澄清。因此考察了PSA與GCB復合凈化的回收率。在綜合考慮回收率、色素凈化效果與成本的基礎上，200 mg PSA+50 mg GCB可取得最佳的凈化效果。

圖3 不同凈化劑對莽草毒素回收率的影響（n=6）Fig．3 Effect of different purificants on anisatin recoveries（n=6）

2.4 方法學評價

2.4.1 基質效應的評價八角中反式茴香醚、有機酸、色素等雜質的存在對莽草毒素的檢測存在干擾。本實驗將莽草毒素配制在乙腈中得到樣品A；對八角樣品進行前處理得到樣品B；對八角樣品進行前處理后加入標準溶液得到樣品C，對上述3個樣品進行同時檢測，并分別以A、B、C作為其回收率值考察基質效應（ME）。

當ME為正值，表示存在基質增強效應；當ME為負值，表示存在基質抑制效應。ME的絕對值大于50%為強基質效應，20%~50%為中等基質效應，而小于20%則為弱基質效應［19-21］。結果表明，莽草毒素經本方法處理后存在弱的基質抑制效應（-8．6%），對結果影響較小。

2.4.2線性范圍與檢出限以乙腈為溶劑，配制1．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0 ng/mL質量濃度的標準溶液，在優化條件下進行測定，以質量濃度為橫坐標（x），定量離子對的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性方程為y=2 029．358 55x+133．657 11。結果顯示，莽草毒素在1．0~100．0 ng/mL質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數（r2）達到0．999 99。分別以3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）［22］，莽草毒素的LOD和LOQ分別為0．006 mg/kg和0．02 mg/kg。與現行方法相比，本方法具有操作簡單、快速和定量準確的優點［1，4］。

2.4.3 回收率與相對標準偏差以八角粉為基質，添加0．02、0．20、0．40、1．00 mg/kg 4個水平的莽草毒素標準品，每個水平進行6次平行實驗，考察回收率與相對標準偏差（RSD），結果見表2。由表2可知，莽草毒素的平均回收率為92．5%~112%，RSD為1．1%~6．0%，方法準確度和精密度滿足GB/T 27404-2008［23］的要求，可應用于八角中莽草毒素的分析檢測。

表2 莽草毒素的回收率及相對標準偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of anisatin（n=6）

2.5 實際樣品檢測

采用本方法對市售的10份八角樣品進行測定，其中2份樣品莽草毒素的含量小于0．02 mg/kg，7份含量為0．02~0．30 mg/kg，1份含量為2．96 mg/kg。由于莽草毒素含量大于1．00 mg/kg應考慮存在摻假可能［8］，因此市售八角存在潛在的摻假問題，有一定的安全風險。

3 結論

本研究建立了一種八角中莽草毒素的QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法前處理簡單快捷，方法學指標滿足檢測要求，適用于八角中莽草毒素的含量檢測及八角的真偽鑒別，在八角的食品安全監管和風險監控方面具有一定的應用價值。