非衍生化/液相色譜-串聯質譜法測定果蔬中氨基酸類有機磷除草劑殘留

林麗敏，張建瑩*，肖 鋒，黃 科，葉 剛，洪小柳，呂 飛

（1．深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；2．惠州海關技術中心，廣東 惠州 516006）

除草劑廣泛應用于農業種植中。隨著農業科技日益更新和抗除草劑轉基因作物的崛起，氨基酸類有機磷除草劑的市場占有率飛速增長，成為23類除草劑之首［1］。氨基酸類有機磷除草劑是指帶有氨基和膦酸基團的氨基酸類除草劑，主要包括草甘膦、草銨膦、雙丙氨膦。該類除草劑對于人體傷害的報道越來越多。研究發現，草銨膦介導抑制谷氨酰胺生成影響中樞系統興奮性，可能引起患者意識障礙、呼吸衰竭［2］。歐洲化學品管理局研究報告顯示，草甘膦可能會傷害人類眼睛和水生生物［3］。歐盟食品安全局將153種農產品的限量從0．1~50 mg/kg降至0．05 mg/kg［4］。GB 2763-2021規定谷物、蔬菜、水果等日常食品中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量分別為0．1~5 mg/kg和0．1~0．9 mg/kg［5］。

目前，針對草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦的研究較多，雙丙氨膦的研究報道較少。蔬菜、水果中草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦的檢測主要采用衍生/液相色譜-串聯質譜法［6］。免疫法、毛細管電泳法和離子色譜法的靈敏度低，不能滿足法律規定的限量要求［7-9］。由于氨基酸類有機磷除草劑具有極性高、不易揮發、不溶于大部分有機溶劑等特點，需將目標物衍生化后進行檢測。常用的氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC）、三氟乙酸酐和七氟丁酰咪唑等衍生試劑［10］具有刺激性氣味，易揮發，吸入后會灼傷人體黏膜，且需使用陽離子交換柱，成本較高，凈化操作繁瑣，檢測效率低。張云峰等［11］建立了一種非衍生化高效液相色譜-串聯質譜快速檢測生物體液中草甘膦、草銨膦及其代謝物等8種極性農藥的方法；Jake等［12］建立了一種非衍生化高效液相色譜-串聯質譜快速測定水中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的方法；非衍生化高效液相色譜-串聯質譜法測定土壤［13］、茶葉［14］、面粉及燕麥［15］和植物油［16］中草甘膦、草銨膦及其代謝物的研究亦有報道。但非衍生化液相色譜-串聯質譜法用于果蔬中氨基酸有機磷類殘留的檢測尚未見報道。

本文以蔬菜、水果為研究對象，以常見的草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦、雙丙氨膦為檢測目標物，采用非衍生化方法，建立了蔬菜、水果中4種氨基酸類有機磷除草劑的液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法具有快速簡便、靈敏度高、成本低、穩定性好等特點，有助于在監管范圍、檢測技術和時效性等方面提升果蔬食品中氨基酸類有機磷除草劑的監測能力。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津8050液相色譜-串聯質譜儀（日本島津公司）；Talboys多管式渦旋振蕩儀（美國Troemner公司）；3K18高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q Integral 10+高純水發生器（美國Millipore公司）；Vac Elut固相萃取裝置（美國Agilent公司）；0．22 μm有機濾膜（上海安譜實驗科技股份公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份公司）；乙酸銨（色譜純，德國Sigma公司）；二氯甲烷（分析純，中國Ghtech公司）；實驗用水為Milli-Q超純水；N-丙基乙二胺吸附劑（GCB，美國Supelco公司）；Oasis HLB柱（6 mL/200 mg，美國Waters公司）。標準物質：草甘膦（CAS號：1071-83-6，純度99．0%）；氨甲基膦酸（AMPA，CAS號：1066-51-9，純度99．0%）；草銨膦（CAS號：51276-47-2，純度99．0%）；草甘膦同位素內標（IS，CAS號：1185107-63-4，純度97．3%）；雙丙氨膦鈉鹽（CAS號：71048-99-2，純度72．4%）。

1.2 樣品處理

1.2.1 提取稱取5．00 g試樣（精確至0．01 g）于50 mL具塞離心管中，加入50 μL 10．0 mg/L草甘膦同位素內標、25 mL水和10 mL二氯甲烷，渦旋振蕩提取20 min，9 500 r/min離心5 min，上清液待凈化。對于柑橘類等酸度較大的水果，取5 mL上清液，加入20 μL氨水調至pH 9，渦旋振蕩均勻，待凈化。

1.2.2 凈化HLB固相萃取柱用5 mL甲醇和5 mL水預淋洗，棄去淋洗液；吸取提取上清液5 mL通過HLB固相萃取柱，收集濾液，渦旋，取1 mL濾液過0．22 μm濾膜，待測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypercarb（100 mm×2．1 mm i．d．，3 μm，美國Thermo公司）。流動相：A為0．2%甲酸水，B為乙腈。等度洗脫程序：0~10．0 min，5% B。進樣量：5 μL；流速：0．25 mL/min；柱溫：40℃。

1.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），離子源溫度：300℃；霧化氣流速：3 L/min；加熱氣流速：10 L/min；驅動氣流速：10 L/min；負離子模式；質譜掃描方式：多反應監測（MRM）；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；駐留時間：100 ms。其他質譜參數見表1。

表1 5種化合物的質譜參數Table 1 Mass spectrum parameters for the detection of 5 compounds

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

比較了Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2．1 mm i．d．，2．7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（150 mm×3．0 mm i．d．，1．7 μm）以及Thermo Scientific Hypercarb（100 mm×2．1 mm i．d．，3 μm）3種色譜柱對4種氨基酸類有機磷及內標物的色譜保留情況。結果顯示，5種物質在Poroshell 120 EC-C18和Thermo Scientific Hypercarb柱上有保留，在ACQUITY UPLC BEH HILIC柱上無保留。各化合物在Thermo Scientific Hypercarb柱上的分離效果和質譜響應較好，最終選擇該柱作為分析柱。

2.2 流動相的選擇

對比了5種流動相：A（乙腈-0．005 mol/L乙酸銨）、B（甲醇-0．005 mol/L乙酸銨）、C（甲醇-0．2%甲酸水）、D（乙腈-0．1%甲酸水）、E（乙腈-0．2%甲酸水）對分離效果的影響。結果顯示，在流動相中加入0．005 mol/L乙酸銨時，草甘膦及內標的響應較低，雙丙氨膦不出峰；用甲酸水作為水相，草甘膦、草甘膦內標、雙丙氨膦均出峰，但響應不高。隨著水相中甲酸含量的提高，草甘膦和草甘膦內標的峰形變好，雙丙氨膦的響應提高（見圖1）。因乙腈的洗脫能力較甲醇強，待測物的峰形較甲醇流動相更好。最終確定以乙腈-0．2%甲酸水作為流動相。

圖1 不同流動相對5種化合物質譜響應的影響Fig．1 Effect of different mobile phases on mass spectrum response of 5 compounds

2.3 提取溶劑的選擇

氨基酸類有機磷除草劑非衍生法的常用提取溶劑有氫氧化鈉［13］、水［14-15］、水與乙腈混合溶液［16］等。本文考察了水、水-二氯甲烷（5∶2，體積比）混合溶液對5種化合物的提取效果。結果表明，對于脂溶性雜質較少的水果樣品，采用上述2種提取溶劑，5種化合物的提取率在80%以上；但對于榴蓮等脂溶性雜質較多的水果樣品，采用水-二氯甲烷（5∶2）混合溶液作為提取溶劑可以破乳破酯，提高提取效率，比單純使用水作為提取溶劑效果更佳。綜合考慮，采用水-二氯甲烷（5∶2）作為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

植物源性食品中含有大量色素及水溶性和脂溶性雜質，其中水果樣品含有高糖等有機物，需凈化去除提取液中的水溶性糖分、水溶性色素等干擾物質。二氯甲烷微溶于水，可溶解多種有機化合物雜質。石墨化炭黑（GCB）對果蔬中的色素（如葉綠素和類胡蘿卜素）及固醇類等系列化合物具有很強的吸附能力。HLB固相萃取柱具有親水-親脂平衡化學結構，是疏水性強且具有良好水浸潤性的聚合物吸附劑，可吸附部分脂肪、脂溶性雜質，除色素效果較好。LC-18固相萃取柱能較好去除脂肪和脂溶性雜質。本文分別比較了二氯甲烷液液萃取凈化、GCB分散固相萃取凈化、Oasis HLB（6 mL/200 mg）、Supelclean LC-18（6 mL/500 mg）固相萃取柱的凈化效果以及二氯甲烷液液萃取法結合Oasis HLB（6 mL/200 mg）固相萃取柱凈化的效果。結果顯示，單獨采用二氯甲烷液液萃取、GCB分散固相萃取凈化時，凈化液的干擾峰多，目標物響應較差；提取液經Oasis HLB萃取柱凈化后，干擾峰少，但草甘膦的峰形較差；經LC-18固相萃取柱凈化后，AMPA的峰形差，且目標物的響應低；采用二氯甲烷和Oasis HLB萃取柱兩者結合的凈化模式凈化，則凈化液的檢測峰少，目標物的響應較高。這可能是由于在水基質提取液中，二氯甲烷在凈化去除部分水溶性糖分、可溶解有機化合物等雜質后，Oasis HLB萃取柱可進一步去除色素、親水性干擾物，兩者起到互補作用，凈化更好。

綜上所述，本方法選取二氯甲烷液液萃取法結合Oasis HLB（6 mL/200 mg）固相萃取柱對提取液進行凈化。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性方程、檢出限與定量下限用水稀釋混合標準溶液，配成質量濃度為0．010、0．020、0．050、0．100、0．200 mg/L的混合標準工作溶液（同位素內標物的質量濃度均為50 μg/L），以峰面積對標準溶液中各被測組分的質量濃度繪制工作曲線。結果表明，4種目標化合物在0．010~0．200 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數（r）均大于0．996。分別以3倍信噪比和10倍信噪比確定方法檢出限和定量下限，4種目標化合物的檢出限均為0．01 mg/kg，定量下限均為0．05 mg/kg。4種氨基酸類有機磷除草劑及內標的MRM譜圖見圖2。

圖2 4種氨基酸類有機磷除草劑及內標的MRM譜圖Fig．2 MRM chromatograms of 4 phosphorus-containing amino acid herbicides and the internal

2.5.2 準確度與精密度采用空白的柑橘、葡萄、麥菜作為驗證基質進行加標實驗，加標水平為0．050、0．100、0．200 mg/kg，每個水平做6個平行。按照本方法進行前處理和檢測，采用內標法定量。由表2可知，3個加標水平下4種化合物的平均回收率為72．2%~109%，相對標準偏差（RSD，n=6）為2．2%~11%，方法的準確度和精密度較好。

表2 4種氨基酸類有機磷除草劑的相關系數（r）、回收率及相對標準偏差Table 2 Correlation coefficients（r），recoveries and relative standard deviations of four amino acid organophosphorus herbicides

（續表2）

2.5.3 方法的實際應用采用該方法檢測10批次鮮柑橘、10批次鮮葡萄和10批次麥菜，結果發現2批次鮮柑橘樣品中檢出草甘膦，檢出量均小于定量下限。

3 結論

本文采用水-二氯甲烷（5∶2）混合溶劑提取目標物，提取液經二氯甲烷液液萃取、HLB固相萃取柱凈化，建立了果蔬中4種氨基酸類有機磷除草劑的非衍生化/液相色譜-串聯質譜測定方法。該法操作簡便，試劑用量少，靈敏度高，穩定性好，且具有較高的回收率、良好的精密度，可滿足果蔬中氨基酸類有機磷除草劑的檢測要求。