向日葵抗鹽堿生理生化機制與生長發(fā)育特性分析

賈秀蘋 卯旭輝 梁根生 劉潤萍 劉 風 王興珍

（1甘肅省農業(yè)科學院作物研究所，730070，甘肅蘭州；2甘肅省農業(yè)科學院農業(yè)經濟與信息研究所，730070，甘肅蘭州）

土壤鹽堿化已成為影響全球農業(yè)的嚴重問題，給農業(yè)生產造成的損失僅次于干旱，使農業(yè)生產的可持續(xù)發(fā)展受到威脅。據(jù)統(tǒng)計[1]，世界鹽堿地面積超過9億hm2，其中我國超過3600萬hm2，主要分布在西北、東北和華北濱海地區(qū)在內的17個省（區(qū)）。土壤鹽堿化嚴重影響我國的農業(yè)生產和生態(tài)環(huán)境，是制約現(xiàn)代農業(yè)增產、增效和實現(xiàn)農業(yè)良性發(fā)展的兩大土壤因素之一[2]。因此，研究植物的耐鹽堿機制、開發(fā)利用耐鹽堿植物資源、培育耐鹽堿作物且有效利用鹽堿地對于全球農業(yè)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境改善具有重要意義。

油用向日葵（簡稱油葵）屬菊科向日葵屬，是世界四大油料作物之一，也是我國第二大油料作物，其種植面積僅次于油菜。據(jù)統(tǒng)計[3]，我國有20多個省（區(qū)）種植向日葵，2016年我國向日葵種植面積為127.9萬hm2，2017年為117.07萬hm2，2018-2019年整體種植面積下滑較快，為91.8萬hm2。其中油葵種植面積約占40.0%，油葵由于其自身基因型及自然條件選擇等綜合因素的影響，具有抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠和適應性強等特性，是生物治理鹽堿地首選作物之一，所以素有抗鹽堿先鋒作物之美稱。

目前，油葵抗鹽堿研究主要集中在苗期生長特點[4]、植株體內離子動態(tài)平衡[5]、生理指標變化[6]以及成熟期含油率和脂肪酸變化[7]等。如陳炳東等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高，根系和地上部分的生長量顯著降低，根系活力呈先增后降的趨勢。劉杰[9]通過鹽堿脅迫對向日葵適應機制影響比較發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫下植株體內Na+含量急劇上升，破壞了植物細胞內離子平衡。裴懷弟等[10]研究了混合鹽脅迫對油葵保護性酶活性、細胞膜透性及其主要農藝性狀的影響，并發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫下油葵各生理指標間變化差異性顯著。也有研究者對向日葵進行基因克隆及染色體定位[11]、遺傳圖譜構建[12]、不同轉錄因子調控[13-15]、滲透劑水平的調控網絡[16]、脂膜結構變化[17]以及抗性[18]等方面的研究。總之，鹽堿對作物的脅迫主要表現(xiàn)為影響作物的形態(tài)結構、光合作用減弱以及細胞膜透性增大等；植物對鹽堿逆境的響應，主要表現(xiàn)為合成滲透調節(jié)物質、提高抗氧化酶活性以及誘導相關基因表達等[19]。但有關油用向日葵F2群體抗鹽堿生理生化變異及抗鹽堿相關性分析研究鮮有報道。生物的耐鹽堿性往往是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，其生理生化過程是基因間相互作用、共同調節(jié)的結果[20]。本研究針對基因間的互作對135株F2油葵抗鹽堿性相關的6個主要生理生化指標及4個形態(tài)指標進行測定與統(tǒng)計，分析了各指標在鹽堿脅迫下生理生化的遺傳變異、分布以及形態(tài)指標間的相關性等情況，為油用向日葵抗鹽堿遺傳研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗地概況

以油用向日葵雜交種隴葵雜2號母本Y05-222A（鹽堿敏感材料）和父本Y06-163R（高抗鹽堿材料）配制F1雜交種，以F1自交得到的135株F2為研究材料。于2018-2019年在甘肅省白銀市靖遠縣五合鎮(zhèn)白塔村（104°58′～105°11′E，36°44′～37°1′N）開展試驗，當?shù)睾０?030m，年均無霜期150d，降雨量200～300mm。試驗共設鹽堿脅迫及對照處理。鹽堿脅迫處理：2018年將親本、F1及F2分別種植于全鹽含量為2.381%、pH 8.27的鹽堿圃，2019年重復該試驗；對照處理：2019年將親本、F1及F2分別種植于土壤全鹽含量為0.025%、pH 6.96的中性土壤。覆膜播種，地膜覆蓋寬度為0.60m，膜間距0.40m，行長6.00m、寬4.00m，小區(qū)面積24.00m2，每個小區(qū)種植8行，行距0.40m，株距0.33m。試驗地前茬為玉米，施農家肥50 000kg/hm2，復合肥250kg/hm2，田間管理同當?shù)卮筇锷a。

1.2 測定項目與方法

2018年6月28日及2019年7月10日對處理的親本及F2種植小區(qū)的各材料隨機取樣20株，對F2進行單株定株、掛牌和取樣，均設3次重復，然后對各取樣材料進行農藝性狀及生理生化指標測定分析。

采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[21]，采用愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性[22]，采用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白含量[23]，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性[24]，采用硫代巴比妥酸顯色法測葉片丙二醛（MDA）含量[22]，采用磺基水楊酸法測定葉片脯氨酸（Pro）含量[24]。

1.3 綜合抗鹽堿系數(shù)統(tǒng)計

成熟期統(tǒng)計各處理株高、莖粗、葉片數(shù)、盤徑和產量等表型數(shù)據(jù)，計算綜合抗鹽堿系數(shù)。綜合抗鹽堿系數(shù)為各指標抗鹽堿系數(shù)的均值，各指標抗鹽堿系數(shù)=鹽堿脅迫條件下某性狀測量值/非脅迫條件下某性狀測量值×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office 2010對數(shù)據(jù)進行處理并作圖，用SPSS軟件進行方差分析、相關性分析、回歸分析以及通徑分析。

2 結果與分析

2.1 親本及F2群體主要生理生化特性分析

通過對親本Y06-136R（P1）和Y05-222A（P2）各生理指標特性分析（表1）可知，2個親本間各指標均達極顯著差異。除親本P1的MDA含量小于P2外，其余各指標P1均大于P2，說明親本P1抗鹽堿能力大于P2。P1和P2的SOD活性分別為660.47和346.58U/mg，F(xiàn)2群體SOD活性變異范圍較大，為100.86～897.25U/mg，均值為552.61U/mg，介于雙親之間。親本P1和P2的POD活性達極顯著水平，F(xiàn)2群體POD活性變化為4.67～91.67U/g，均值為45.60U/g，高于雙親值。F2群體CAT活性均值為32.86U/g，其親本P1和P2的CAT活性分別為12.22和2.58U/g，F(xiàn)2群體均值明顯高于雙親值，且變異范圍較大，為2.39～66.00U/g。F2群體可溶性蛋白含量變化為9.79～41.67mg/g，均值為24.10mg/g，低于雙親值。親本P1和P2的Pro含量分別為146.15和95.67μg/g，親本間差異達極顯著，F(xiàn)2群體Pro含量均值為219.49μg/g，高于親本值。F2群體MDA含量均值為57.97μmol/g，高于雙親值。F2群體抗鹽堿系數(shù)均值為0.70，介于雙親之間，其變異范圍為 0.22～0.90。

2.2 F2群體主要生理生化特性變化分布

如圖1所示，F(xiàn)2群體中各指標間存在較大的遺傳差異，并在一定范圍內呈連續(xù)分布。同時對F2群體進行偏度及峰度分析，結果顯示P＞0.05，說明各指標值均符合正態(tài)分布。同時由表1可知，SOD活性及抗鹽堿系數(shù)在F2群體中的均值介于雙親之間。POD、CAT、Pro和MDA等指標均高于雙親，可溶性蛋白含量低于雙親，其原因主要由超親分離所致。

圖1 F2群體相關指標的次數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of related indicators for F2population

表1 親本及F2群體主要生理生化指標變異及特異性分析Table 1 Performance and analysis of specificity of physiological indicators in the F2population and its parents

2.3 F2群體主要生理生化變化與抗鹽堿相關性分析

通過對F2群體抗鹽堿相關指標及抗鹽堿系數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，各指標間存在一定的相關關系。由表2可知，F(xiàn)2群體抗鹽堿系數(shù)與SOD、POD、CAT活性和Pro含量均呈極顯著正相關，其相關系數(shù)分別為0.3904、0.5256、0.2987和0.3298；與可溶性蛋白和MDA含量呈極顯著負相關，其相關系數(shù)分別為-0.2675和-0.3725。說明在一定范圍內高活性的SOD、POD、CAT以及Pro含量與低含量的可溶性蛋白及MDA可作為油用向日葵抗鹽堿性能鑒定的指標。

表2 F2群體各指標與抗鹽堿相關性分析Table 2 Correlation analysis salt-alkali resistance coefficient and related indicators in the F2population

2.4 F2群體主要生理生化變化與抗鹽堿性回歸分析

對F2群體的SOD、POD、CAT活性及可溶性蛋白、Pro、MDA含量等6個指標采用全因子組合最優(yōu)回歸，通過共線性判斷挑選出最優(yōu)回歸方程。Y=0.5356+0.0001X1+0.0039X2+0.0019X3-0.0015X4-0.0009X6。式中Y為抗鹽堿系數(shù)，X1為SOD活性，X2為POD活性，X3為CAT活性，X4為可溶性蛋白含量，X6為MDA含量。從方程可知，可溶性蛋白和MDA含量與抗鹽堿系數(shù)呈負相關，其方程回歸系數(shù)分別為-0.0015和-0.0009。

2.5 F2群體主要生理生化變化與抗鹽堿性通徑分析

由表3可知，F(xiàn)2群體POD、SOD、CAT活性及MDA、可溶性蛋白和Pro含量與抗鹽堿系數(shù)間的直接通徑系數(shù)分別為0.5003、0.1676、-0.1317、-0.1040、0.0657和-0.0384（正向表示促進作用，負向表示抑制作用）。其中POD活性對抗鹽堿性能的影響最大，可溶性蛋白對抗鹽堿性能的貢獻較小。SOD、POD、CAT、可溶性蛋白、Pro和MDA與抗鹽堿系數(shù)總間接通徑系數(shù)分別為0.2228、0.0253、0.4303、-0.3333、0.3682、-0.2684。通過通徑分析與相關分析比較發(fā)現(xiàn)，SOD活性與抗鹽堿性的相關系數(shù)為0.3904，直接通徑系數(shù)為0.1676，間接通徑系數(shù)為0.3291，可見，SOD活性對抗鹽堿性能的影響主要是通過影響POD的活性而起間接作用。

表3 F2群體各指標與抗鹽堿性通徑分析Table 3 Path analysis of salt-alkali resistance coefficient and its indexes of F2population

POD活性與抗鹽堿性的相關系數(shù)為0.5256，通徑系數(shù)為0.5003，可見，POD活性對抗鹽堿性的直接影響較大。CAT活性主要是通過POD活性對抗鹽堿性的間接影響較大，間接通徑系數(shù)為0.3343。可溶性蛋白與Pro含量均是通過POD和SOD活性對抗鹽堿性的間接影響，其總間接通徑系數(shù)分別為-0.3333和0.3682。MDA含量通過POD活性對抗鹽堿性的間接影響較大，間接通徑系數(shù)為-0.2985。

2.6 親本及F2群體主要外部形態(tài)特征的變異分析

對親本（P1、P2）株高、莖粗、葉片數(shù)和盤徑形態(tài)特征的分析（表4）可知，各指標間均達顯著或極顯著差異，4個指標均值均為P1大于P2。P1和P2的株高分別為148.30和96.53cm，F(xiàn)2群體株高變異幅度較大，為36.42～166.18cm，均值為110.98cm，介于雙親之間。F2群體莖粗變異范圍為0.54～2.25cm，均值為1.42cm，與親本P2莖粗值接近。葉片數(shù)與盤徑變異范圍分別為5.00～12.00和3.20～12.40cm，均值均介于雙親之間。

表4 親本F2群體主要形態(tài)特征變異分析Table 4 Analysis of morphological characteristics in parents and F2population

2.7 F2單株主要形態(tài)特征與抗鹽堿相關性分析

研究表明，F(xiàn)2單株各主要形態(tài)指標間均達極顯著正相關。由表5可知，株高與葉片數(shù)、盤徑以及葉片數(shù)與盤徑相關系數(shù)分別為0.9150、0.9378和0.9238。抗鹽堿系數(shù)與各形態(tài)指標間均成極顯著正相關關系，其與株高、莖粗、葉片數(shù)和盤徑間的相關系數(shù)分別為0.8501、0.8440、0.8786和0.8759，說明株高、莖粗、葉片數(shù)以及盤徑均可作為抗鹽堿性強弱的主要衡量指標。

表5 抗鹽堿系數(shù)與F2群體形態(tài)特征相關性分析Table 5 Correlation analysis of salt-alkali resistance coefficient and morphological characteristics in F2population

3 討論

本研究通過對親本Y06-136R和Y05-222A各生理指標特異性分析得出2個親本間各指標值均達極顯著差異。同時對135份油葵F2群體的SOD、POD和CAT活性等6個生理生化指標進行測定分析，各指標在一定范圍內呈連續(xù)分布。同時對F2群體進行偏度及峰度分析，結果顯示P＞0.05，說明各指標值均符合正態(tài)分布，表明了數(shù)量性狀的遺傳特點。

通過對油用向日葵F2群體生理生化指標間的相關性分析發(fā)現(xiàn)，各個指標并非獨立的對某個性狀起作用，而是指標間以相互關聯(lián)的方式作用于某些性狀。本研究表明，油用向日葵F2群體的抗鹽堿系數(shù)與可溶性蛋白及MDA含量呈極顯著負相關，與POD、SOD和CAT活性以及Pro含量呈極顯著正相關。相關研究[25]報道，植物在逆境條件下，膜脂的過氧化作用產生MDA，通過MDA含量可分析膜質過氧化程度，因此，MDA含量可作為研究植物對逆境條件反應強弱的指標。可見在鹽堿逆境條件下降低MDA含量，使質膜過氧化程度變小，有利于提高油葵的抗鹽堿性。相反，在逆境條件下增加MDA含量，質膜過氧化程度加大，質膜通透性增加，抗鹽堿性減弱。同時提高POD、SOD、CAT活性以及Pro積累量，有利于提高油葵的抗鹽堿性能。

通徑分析是表示變量間因果關系程度的一個指標，通徑系數(shù)為標準化的偏回歸系數(shù)。通過對F2群體各生理生化指標的通徑分析，發(fā)現(xiàn)各指標抗鹽堿相關系數(shù)與總間接通徑系數(shù)一致，說明各指標對抗鹽堿性的作用主要是通過對其他指標的影響而起間接作用，這與相關性分析結果一致。直接通徑系數(shù)中，CAT、Pro與抗鹽堿系數(shù)成負相關，這與相關性分析有差異，主要是由于CAT和Pro對F2群體抗鹽堿性自身的貢獻率較小或成負貢獻，但通過對其他各指標的正向影響而提高群體的抗鹽堿性。可溶性蛋白含量本身對F2群體的抗鹽堿性有提高作用，但對其他指標有抑制作用，所以總體對F2群體的抗鹽堿性表現(xiàn)為負相關。其他各指標對油葵抗鹽堿性是通過直接和間接影響共同起作用。通徑分析更直觀、具體、明了地體現(xiàn)各指標間的相互關系。

通過對F2單株形態(tài)特征分析研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫直接影響植物的形態(tài)建成和生長發(fā)育。逆境使細胞的正常分裂受到影響，從而抑制植物的生長發(fā)育以及生物量的積累，使株高降低、莖粗變細、葉片數(shù)減少和盤徑變小。本試驗進一步發(fā)現(xiàn)，油用向日葵的抗鹽堿性與株高、莖粗、葉片數(shù)及盤徑各形態(tài)指標間存在極顯著正相關關系，這表明株高、莖粗、葉片數(shù)以及盤徑可作為油用向日葵抗鹽堿衡量的主要形態(tài)指標。同時觀察發(fā)現(xiàn)抗鹽堿性強的植株葉片的表皮毛較發(fā)達且多具角質層，葉片厚度較大。

因此，植物的生長、發(fā)育與其所處環(huán)境密不可分，在逆境環(huán)境中通過調節(jié)自身生理生化指標，以及形態(tài)特征的變異增加對逆境的忍耐度和適應性。宏觀的表現(xiàn)特征蘊涵著微觀的基因調控機制，主要表現(xiàn)為影響植物的形態(tài)特征，以及光合作用減弱和細胞膜透性增大等[26]。

Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，性狀間的顯著相關與相應的部分QTL間存在一定的連鎖或一因多效，所以對上述生理生化及形態(tài)特征各指標間的相關性分析可進一步了解指標間的相互關系，為以后油用向日葵抗鹽堿分析提供參考依據(jù)。

4 結論

通過鹽堿脅迫對油葵親本Y06-136R和Y05-222A以及135份F2群體的SOD、POD和CAT活性等6個生理指標特異性、抗鹽堿系數(shù)和單株形態(tài)特征等進行系統(tǒng)分析。發(fā)現(xiàn)無論是親本還是后代群體各生理指標并非獨立對某個性狀起作用，而是各指標間以相互滲透，相互關聯(lián)的方式共同作用于某些性狀。其中抗鹽堿系數(shù)與POD、SOD、CAT活性以及Pro含量呈極顯著正相關，與MDA含量呈極顯著負相關，進一步說明，逆境條件下油葵可通過自身調節(jié)以提高POD、SOD、CAT活性及Pro含量，降低MDA含量，可有效提高抗鹽堿性。

另外，通過表型與抗鹽堿系數(shù)相關性研究發(fā)現(xiàn)，提高油葵的株高、莖粗、葉片數(shù)及盤徑可提高其抗鹽堿性，同時發(fā)現(xiàn)抗鹽堿性強的植株葉片表皮毛發(fā)達且蠟質層增加，葉片肥厚。