響應面法優化無核白葡萄果醋發酵工藝

嚴玉玲，郭 焰，豆一玲，黃文書

（1.新疆輕工職業技術學院，新疆 烏魯木齊 830021；2.新疆農業大學，新疆 烏魯木齊 830052）

無核白葡萄果呈橢圓形，果糖含量多，是葡萄中的“綠色明珠”[1]。該品種含糖量可達20%～30%，含酸量種類多，富含多種蛋白質和營養素。時常食用能有效抗氧化、耐衰老、預防癌癥、調節心血管及內分泌系統。近年來，葡萄醋飲料受到老百姓的喜愛，是在現代生物技術的基礎上加工而成的，營養價值頗為豐厚。口味尚佳，深受消費者喜愛[2-3]。無核白葡萄營養價值高但其加工水平較低，基本處于初級加工階段[4]。

液態發酵具有發酵周期短、產量高、易于操控的優點，但仍有不足之處，最明顯的缺點是菌種單一、酸味濃厚。保證在不改變酵母菌生長狀態的基礎上，盡量食用混合菌種來發酵，能為發酵階段提供豐富的風味物質[5-6]。利用新疆富足的葡萄資源研發葡萄醋產品不僅符合未來的市場發展方向，還減少了銷售新鮮葡萄的壓力。更重要的是，提供了深度加工和綜合利用葡萄的實用方法，為未來葡萄醋飲料的工業生產提供了理論基礎和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核白葡萄，市售；高活性干酵母，深圳尚格酵母有限公司提供；乳酸菌，學院保藏；中科AS1.41活性醋酸桿菌，上海佳民釀造食品有限公司提供；果膠酶（50 000 U/g），（食品級），上海祁邦實業有限公司提供；蔗糖（食品級），符合GB/T 317—2006標準。

1.2 儀器和設備

HPS-250型生化培養箱，黑龍江月東電子技術開發有限公司產品；DZKW-D-2型恒溫水浴鍋，北京市山島儀器有限公司產品；LDZX-50KB型立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海中安醫療器械廠產品；超凈工作臺，蘇州凈化有限公司產品；WYT型手持糖度儀，成都光學廠產品；PHS-3C型pH計，江蘇億達儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 無核白果醋制備工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）原料預處理[7]。甄選葡萄粒，清洗揉碎，并加入質量分數為0.2%的異維C鈉溶液以進行顏色保護。

（2）果膠酶處理。將0.1%果膠酶加入帶有葡萄果皮的果汁中，于50℃下保持1 h，然后加熱至70～80℃以滅活果膠酶10 min，增加果汁產量，這有助于提升在后發酵時菌體與果汁的接觸率。

（3）成分調整。如果未涉及發酵過程中產生的中間產物，則每千克糖可以生產約0.67 kg醋酸，可以通過預期的酒精含量添加蔗糖來調節葡萄汁的糖含量。加入檸檬酸，將發酵原料的酸含量調節至0.8%～1.2%。將調整后無核白葡萄果汁裝入容器中，于65℃水浴條件下進行滅菌處理0.5 h。

（4）酵母活化。制備質量分數為4%～5%的蔗糖溶液，煮沸，將其冷卻至35～40℃，加入活性干酵母，水化處理15～20 min，溫度冷卻至34℃，活化2 h后存儲[8]。

（5）混菌酒精發酵。按比例量取酵母菌和乳酸菌，以一定的比例與無核白葡萄汁混合，于37℃水浴中溫育，直到出現了大量氣泡后才能活化，將其接種到處理過的果汁中并在合適的溫度下發酵。當液面無氣泡產生標志著發酵完成[9]。

（6）醋酸發酵。將保存在斜面上的醋酸菌接種到含有醋酸菌的活化培養基中，在30℃下振蕩培養24 h，然后用顯微鏡檢查，確保細菌良好。細菌數量增加10%后，將酒精發酵液和醋酸菌種子混合均勻置于33℃的環境中。發酵完成后，進行粗過濾和用澄清劑的澄清。

1.3.3 混菌酒精發酵試驗

將滅菌后的無核白葡萄原液，冷卻至室溫后，按5%總接種量接入擴培后的酵母菌和乳酸菌，2種菌分別按4∶1，3∶2，1∶1，2∶3，1∶4（V/V）的比例混合，用紗布封口，30℃下恒溫靜置發酵，定期觀察發酵液的變化情況，并規律地測定發酵液酒精含量，糖分占比等參數確定適宜的混合菌配比。

酵母菌與乳酸菌的總接種量分別為1%，3%，5%，7%，9%。在設定的條件下發酵直至發酵結束，最后檢測發酵液中酒精含量可知酵母和乳酸菌最佳配比的數值[10-11]。

1.3.4 無核白果醋發酵單因素試驗

分別選取醋酸菌接種量（5%，8%，10%，12%，15%，20%）、初始酒精度（3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%）、發酵的溫度（22，25，28，30，32，35℃）、發 酵 液pH值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5）對這4個因素進行單因素試驗，根據發酵液中酸的總含量確定適宜的發酵條件，便于響應面優化試驗。

1.3.5 無核白果醋發酵響應面試驗

在單因素測試結果的基礎上，運用發酵后測得的酸的總含量為響應值，選取接種量（X1）、初始酒精含量（X2）和發酵的溫度（X3）為響應值面分析因素，設計了三因素三水平，一共15個測試點的響應面分析試驗。

響應面分析因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平設計

1.3.6 測定方法

酸的總含量測定，NaOH滴定法（GB 7698—2014）；酒精度，蒸餾比重法；pH值的測定，PHS-3C型pH計；可溶性固形物，手持糖度計法。

2 結果與分析

2.1 混菌酒精發酵過程試驗結果

2.1.1 酵母菌和乳酸菌接種配比的優化

酵母菌與乳酸菌最佳配比試驗見表2。

表2 酵母菌與乳酸菌最佳配比試驗

由表1可知，當酵母和乳酸菌的配比為3∶2時，測得的酒精度為7.8%，此時為最高含量為總酸含量為3.6 g/L，最小殘糖含量為7.1 g/L，其他比例產生的酒精相對較低，因此可以確定酵母和乳酸菌的最佳配比為3∶2。

2.1.2 酵母菌和乳酸菌接種量的優化

菌種接種量對酒精發酵過程的影響見圖1。

圖1 菌種接種量對酒精發酵過程的影響

由圖1可知，接種1%的酵母時，由于接種量過低，酵母繁殖緩慢，容易生長細菌，進而造成發酵過程中產生較少的酒精；當接種的酵母為5%或7%時，發酵達到7 d時，產生的酒精度低于3%接種產生的酒精含量。可能是由于酵母接種量過高，容易產生過多的代謝廢物，從而影響正常的發酵過程。因此，可以確定混合發酵時的細菌接種總量為5%，其中酵母接種量為3%，乳酸菌接種量為2%。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 醋酸菌接種量對無核白果醋發酵的影響

醋酸菌接種量對產酸率的影響見圖2。

圖2 醋酸菌接種量對產酸率的影響

由圖2可知，5%的醋酸菌接種量不足以使得發酵快速完成，所需時間較長。酸生成速度慢，發酵完成的時間較長，發酵全部完成時的酸的總量也很低。當大于10%的接種量時早期產酸速度高，隨著時間的推移，后期菌體代謝能力降低生長速度放緩慢，對于發酵整體不易調控。在接種量為8%～10%時酸的生長數量十分迅速，在完成總體發酵時酸總量也十分高。接種量不大時菌體的生長速度慢，發酵周期也會受到影響，進而影響生產效率，所需的成本較高；相反，接種量大的菌體生產旺盛，菌種的壽命縮短，前期營養的消耗較大，影響到材料的轉化效率，所需的經濟成本也過大。只有在接種量適中的區間，菌體生長能縮短發酵所需要時間，使發酵過程中盡量不會被污染，整體增加產品的產酸速度和產品質量。在研究無核白葡萄果醋發酵的影響條件中，醋酸菌接種量最合適的范圍是8%～10%。

2.2.2 發酵液初始酒精度對無核白果醋發酵的影響

初始酒精度與總酸含量之間的關系見圖3。

圖3 初始酒精度與總酸含量之間的關系

由圖3可知，開始發酵的酒精度越高，間接影響著總酸生成量。總酸含量隨著一開始的酒精度數升高呈現先上升后降低的趨勢，在7%（V/V）時可達到最大值，此時的數值為6 g/100 mL。原因可以歸結為酒精度數有助于菌的生成，為菌的生長提供了良好的生存環境。由圖3可知，7%是最合適的酒精度數。

2.2.3 醋酸發酵溫度對無核白果醋發酵的影響

醋酸發酵溫度與總酸含量之間的關系見圖4。

圖4 醋酸發酵溫度與總酸含量之間的關系

由圖4所知，溫度對總酸的含量有著十分重要的影響，溫度越高分子運動越劇烈，但是這個影響并不是一直正相關，轉折點出現在30℃，大于這個溫度，酸的總量不會迅速增長。由圖4可知，總酸含量增速降低，29℃為最適溫度。

2.2.4 發酵液pH值對無核白果醋發酵的影響

發酵液pH值對總酸含量的影響見圖5。

圖5 發酵液pH值對總酸含量的影響

由圖5可知，當醋酸菌在菌落環境pH值為3.5時，底酸濃度太高的話不利于醋酸菌生長繁殖，從而導致在6 d以后醋酸菌不再繁殖，轉化率幾乎不再增長；而當pH值為5.5時，在6 d以后產酸量反而逐漸降低，原因可能是出現嚴重的過氧化現象。因此最優的初始pH值應在4.0～5.0。

此模型用來探究影響試驗的條件具體硬性的效果如何。

Box-behnken試驗設計結果分析見表4。

表4 Box-behnken試驗設計結果分析

2.3 響應面試驗優化醋酸發酵結果

探究無核白果醋發酵最合適條件，響應值設定為總酸含量。通過響應面軟件設計三因素三水平分析試驗。

Box-behnken響應面試驗設計表及結果見表3。

表3 Box-behnken響應面試驗設計表及結果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

根據測定結果建立相關的數學模型為：

由表4可知，模型的Prob＞F項小于0.05（數據＜0.0001），說明處理后的數據結果十分突出，當X1、X2、X3的Prob＞F值小于0.01，無核白葡萄果醋發酵總酸含量與醋酸菌的接種量、初始酒精度和發酵的溫度呈正相關。當Prob＞F值為＞0.01（為0.058 8），失擬項不明顯，選擇擬合模型。此外，利用軟件計算顯示相關模型系數R2=98.32%，大于90%。模型預判貼近，通過軟件分析得到相關變異系數（CV），變異系數反映模型的置信度，CV值越低模型的執行度越高，試驗的CV值為2.66%。說明此模型具有指導價值，可以進一步研究應用。

2.3.2 無核白醋酸發酵試驗的響應曲面分析及優化[12]各因素相互作用對醋酸發酵的曲面響應圖見圖6。

圖6 各因素相互作用對醋酸發酵的響應曲面圖

由圖6（a）可知，發酵液酸的含量大的菌種條件分別為接種量為10%，初始酒精度為6%。由圖6（b）可知，接種量為10%時，發酵溫度為28.96℃時，發酵液中總酸含量達到最大值。由圖6（c）可知，初始酒精度為6%時，發酵溫度為28.96℃時，總酸最多。根據以上數據，得出醋酸發酵的最佳條件為接種量10%，初始酒精度6%，發酵溫度28.96℃，依據模型方程預測得到發酵液總酸含量6.65 g/100 mL。

2.3.3 驗證試驗

為檢驗此模型可靠性，根據試驗的結果對接種量、初始酒精度及發酵溫度進行微調，選擇10%接種量，6%初始酒精度，28.5℃環境溫度作為發酵過程的外界條件操作試驗，最終發酵液中總酸含量為6.67 g/100 mL，與模型預測的值（6.65 g/100 mL）相差較小，說明了回歸方程對實際應用具有指導作用。

3 結論

在單因素試驗基礎上，使用響應面軟件探究了無核白葡萄果醋醋酸發酵條件的影響值，利用模型最終確定接種量為10%，初始酒精度為6%，溫度為28.5℃。發酵完成后發酵液中的總酸含量為6.67 g/100 mL。同時，發酵中途加入乳酸菌多菌種的共同發酵，能提高體系中風味物質的含量，進而使得后期生產的飲料口感更好。混菌發酵工藝試驗結果表明，釀酒酵母和乳酸菌的總菌接種量為5%，接種比例為3∶2時，發酵效果最佳。