近紅外熒光探針用于生物硫醇的高靈敏檢測

藍敏煥，龐 娥，趙少靜，潘唐納

(中南大學化學化工學院，湖南 長沙 410083)

細胞內的生物硫醇，如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)及谷胱甘肽(GSH)，通過氧化還原反應參與機體代謝，其濃度的變化與多種疾病有關[1-2]。例如GSH濃度異常與惡性腫瘤、艾滋病、肝損傷和神經退行性疾病有關，Cys的濃度變化與生長緩慢、脫發和肝損傷相關，而Hcy是心血管疾病和阿爾茨海默病的標志物之一[3-5]。因此，生物硫醇的高靈敏檢測對于疾病的早期診斷和評估進展具有非常重要意義[6-8]。

近年來，科研人員開發了多種方法用于檢測細胞內生物硫醇的濃度，包括電化學發光法[9]、酶聯免疫法[10]和比色法[11]等。然而這些方法仍然存在一些不足，例如電化學發光法重現性差、酶聯免疫法容易出現假陽性結果，而比色法靈敏度較低。熒光探針技術具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好，可以在線監測等優點，在生物硫醇的檢測領域具有獨特的優勢。湯等人選擇2'-羥基查爾酮作為熒光團，2，4-二硝基苯磺酸酯基團作為識別基團，設計合成了一個熒光開啟型熒光探針。該探針與生物硫醇反應后釋放出查爾酮并恢復其熒光，實現了水溶液和細胞中生物硫醇的高靈敏檢測[12]。張等人以香豆素為熒光團，2，4-二硝基苯磺酰胺為識別單元，基于分子內光誘導電荷轉移機制，開發了一種香豆素類新型熒光增強型探針CPH，當檢測到苯硫酚后，香豆素熒光團被釋放，溶液的熒光恢復，從而實現水溶液中苯硫酚的檢測[13]。郭等人制備了氮、硫摻雜的碳點，在碳點水溶液中加入Cu2+后導致熒光猝滅，當向碳點-Cu2+體系中加入硫醇衍生物后，由于硫醇與Cu2+具有更強的結合能力，可以將Cu2+從碳點的表面被移除，碳點的熒光恢復[14]。然而，很多熒光探針水溶性較差，有的需要在較高或較低pH條件下進行檢測，有的選擇性較差。因此，開發一種能夠克服這些缺點的熒光探針具有十分重要的意義[15]。

本文以三苯氨基噻吩基團為強給電子基團，以氰基作為強吸電子基團，合成了一種可檢測生物硫醇的有機小分子熒光探針TTCNPy。進一步利用納米沉淀法將其制備成具有良好水溶性的納米顆粒，用于檢測水溶液和細胞中的生物硫醇。該納米顆粒具有近紅外熒光發射(λem=727 nm)及較大的斯托克斯位移(260 nm)，能夠在pH=7的緩沖溶液中靈敏地檢測到生物硫醇，并具有較高的選擇性和抗干擾能力。生物硫醇中巰基的強親核進攻能力能夠破壞熒光探針的共軛π鍵，導致探針熒光猝滅，從而實現對細胞中生物硫醇的定量檢測。TTCNPy納米顆粒具有合成簡便、水溶性好、靈敏度高、選擇性高、細胞毒性低的優點[16]。

1 實驗方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗中使用的試劑均購自希恩斯和J&K，未進行額外的提純。所用溶劑均為高效液相色譜級；所用無水溶劑均按照有機溶劑純化手冊進行處理；所用柱層析硅膠為200～300目。在400MHz核磁共振儀器(Bruker)上測試了1H NMR和13C NMR譜。用Xevo G2 QTOF MS(Waters)記錄化合物的高分辨質譜(HRMS)。紫外可見吸收光譜在島津UV2600分光光度計上測量；熒光光譜在島津RF-6000熒光分光光度計上測量；細胞成像實驗使用熒光倒置顯微鏡進行。

1.2 TTCNPy的合成及表征

TTCNPy分子的合成路線如圖1所示。

圖1 TTCNPy的合成路線Fig.1 Synthetic route of TTCNPy

1.2.1 TTCN-Br的合成

將1 mmol對溴代苯乙腈和1.5 mmol t-BuOK依次加入到10 mL無水乙醇中，常溫攪拌10 min后，將0.5 mmol的TT-CHO加入到該溶液中，90 ℃回流4 h后，冷卻到室溫，旋蒸除去溶劑，粗產物用硅膠純化，正己烷/乙酸乙酯梯度洗脫可以得到黃色固體，產率約為75%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)，δ 7.60(s,1H)，7.58～7.48(m,7H)，7.24～7.34(m,5H)，7.26(s,8H)，7.16～7.11(m,4H)，7.07(d,J=11.8,4.9 Hz,4H).

1.2.2 TTCNPy的合成

將0.2 mmol TTCN-Br，0.5 mmol CH3I溶解到5 mL乙腈中，90 ℃回流8 h，冷卻到室溫，加入25 mL乙醚，收集過濾固體，在真空干燥箱中烘干后，溶解于10 mL丙酮，5 mmol KPF6溶于2 mL水中后，加入丙酮溶液中，混合液室溫攪拌24 h，旋蒸除去溶劑，粗產物用硅膠純化，CH2Cl2/CH3OH=8/1作為洗脫劑，分離得到深紅色固體，產率約為50%。1H NMR(400 MHz,CD3CN),δ 8.52(d,J=6.9 Hz,2H),8.18(d,J=7.0 Hz,2H),8.01(s,1H),7.94(d,J=8.6 Hz,2H),7.85(d,J=8.6 Hz,2H),7.63(d,J=4.0 Hz,1H),7.57～7.52(m,2H),7.36(d,J=4.0 Hz,1H),7.27(d,J=10.6,5.3 Hz,4H),7.06(t,J=7.8 Hz,6H),6.94(d,J=8.7 Hz,2H),4.19(s,3H).紅外光譜，1 635，1 573，1 496和1 429 cm-1為苯環骨架C=C環呼吸振動峰。615 cm-1為噻吩環上的C-S鍵振動。2 206 cm-1為C≡N的紅外吸收峰。

1.2 TTCNPy納米顆粒的制備

TTCNPy納米顆粒通過納米沉淀法制備。首先將1 mmol TTCNPy溶于2 mL THF中，在超聲下加入到50 mL超純水中，2 h后轉入到100 mL燒瓶中，并在室溫下不斷攪拌24 h除去溶液中的THF，得到橙紅色液體，然后用0.22 μm的水相濾膜過濾，得到制備好的TTCNPy熒光探針納米顆粒[17]。

1.3 紫外可見吸收光譜和熒光光譜

用空白溶劑校準后，向比色皿中加入TTCNPy納米顆粒的水溶液。用移液槍吹勻后，加入不同濃度的生物硫醇，并在測試前再次吹勻，收集其紫外可見吸收光譜和熒光光譜。

1.4 探針的檢測限計算

計算好不同比例的生物硫醇所需要母液的體積，取10 μL濃度為2 mmol的TTCNPy納米顆粒母液加入2 mL緩沖溶液中，然后用移液槍移取一定體積的生物硫醇滴加到含TTCNPy納米顆粒的緩沖溶液中。測試TTCNPy探針溶液的熒光光譜，按照下式計算探針的檢測限。

LOD =Kσ/κ

上述符號的含義：K代表置信水平系數，光譜測試中K=3；σ代表空白樣品測量20次以上信號的標準偏差；κ是727 nm處探針的熒光強度與生物硫醇濃度之間的線性關系的斜率。

1.6 選擇性實驗

在探針溶液中分別加入相同濃度的Hcy、Cys、GSH或其他不含巰基的氨基酸中，反應相同的時間后，分別檢測其熒光光譜。

1.7 細胞毒性實驗

通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)分析評估TTCNPy納米顆粒對4T1細胞的毒性。將4T1細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的培養基中，在37 ℃下，體積分數為5% CO2和95%空氣環境中培養，將細胞接種在96孔板中，24 h后更換含(2～10 μmol)的TTCNPy納米顆粒的培養基，再經過24 h孵育后添加200 μL帶有MTT(5 mg/mL)溶液的新鮮培養基。在37 ℃下孵育4 h后，棄去MTT溶液，并加入200 μL DMSO。在酶標儀下測量每個孔在490 nm處的吸光度。

2 結果與討論

2.1 TTCNPy納米顆粒的表征

我們首先通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察確定TTCNPy納米顆粒的尺寸。如圖2a所示，TTCNPy納米顆粒呈球狀結構，直徑約為20～30 nm左右，這種尺寸的納米顆粒有利于細胞吞噬。具有近紅外熒光且大斯托克斯位移的熒光材料在生物成像

λ/nm

應用中具有背景干擾低、對生物樣品的光損傷小、樣品穿透性強、檢測靈敏度高等優點。TTCNPy納米顆粒水溶液的紫外可見吸收光譜和熒光光譜如圖2b所示，其在467 nm處有最大吸收峰，在727 nm處有熒光發射峰，斯托克斯位移達到260 nm。

1.5 TTCNPy納米顆粒在不同pH條件下對生物硫醇的光譜響應

在不同pH條件下，不同熒光探針對生物硫醇的響應有一定規律性[18]。我們系統研究了TTCNPy熒光探針在不同pH條件下對3種生物硫醇的響應，如圖3所示，在相同時間內，加入10 μmol的Hcy、Cys、GSH后TTCNPy納米顆粒的熒光強度顯著降低；并且隨著pH的增加，TTCNPy納米顆粒的光譜對生物硫醇的響應也逐步增加(如圖3d)，這是由于在堿性條件下，巰基變成了親核能力更強的硫負離子，更容易進攻碳碳雙鍵，導致TTCNPy探針的熒光被更高效地猝滅。

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2.3 TTCNPy納米顆粒對不同濃度生物硫醇的吸收和熒光光譜響應

為了探究TTCNPy納米顆粒與生物硫醇識別過程的響應時間，向配制好的10 μmol TTCNPy納米顆粒中加入相同濃度的Hcy、Cys、GSH，每隔10 min測試1次TTCNPy納米顆粒的紫外可見吸收光譜和熒光光譜。如圖4所示，隨著時間的延長，TTCNPy納米顆粒的熒光逐漸被猝滅，在100～150 min熒光強度幾乎沒有變化，說明此時反應已經基本結束，則可以確認TTCNPy納米顆粒與生物硫醇的反應時間約為100 min[19-20]。

2.4 TTCNPy納米顆粒對生物硫醇的靈敏度測試

為了考察TTCNPy納米顆粒對生物硫醇的靈敏度測試，我們通過紫外吸收變化及熒光光譜滴定實驗來進行評價(圖5)[21-22]。在配制好的TTCNPy探針(10 μmol)中逐漸滴加Hcy、Cys、GSH(1～8 μmol)，可以觀察到隨著生物硫醇的加入，納米顆粒在467 nm的吸光度和727 nm處熒光逐漸降低。當加入8 μmol的生物硫醇時，熒光強度不再降低。通過對TTCNPy納米顆粒在727 nm處的熒光發射與生物硫醇滴加的濃度進行線性擬合，可以觀察到熒光發射與濃度在0～6 μmol的生物硫醇之間有良好的線性關系(插圖)。根據實驗結果，可以計算出熒光探針TTCNPy納米顆粒對Hcy、Cys、GSH的檢測限分別為0.479，0.429，0.480 μmol。上述結果表明TTCNPy納米顆粒對生物硫醇具有較高的檢測靈敏度[12]。

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2.5 TTCNPy納米顆粒對生物硫醇的選擇性和檢測機理解釋

我們考察了TTCNPy納米顆粒對生物硫醇或常見不含巰基氨基酸的熒光響應[23-25]。如圖6a所示，向配制好的TTCNPy納米顆粒(10 μmol)中分別加入相同濃度的Hcy、Cys、GSH、Lys、Pro、Tyr、Arg、Leu、Ala、Thr、His、Asp、Trp、Glu、Cystine、Gly、Ser、Met、Pre、Val，等待反應100 min。通過對比，可以觀察到只有加入生物硫醇，TTCNPy納米顆粒的熒光才會被顯著猝滅，在加入其他不含巰基的氨基酸時，TTCNPy納米顆粒的熒光強度幾乎沒有明顯變化。上述結果表明TTCNPy探針對生物硫醇具有良好的選擇性。

為了探究TTCNPy納米顆粒對生物硫醇具有選擇性的原因，我們通過TTCNPy與Cys反應前后的質譜進行了驗證。由于氰基的吸電子能力極強，導致碳碳雙鍵上的電子分布不均，而生物硫醇中巰基中的硫原子含有一對孤對電子，具有強親核能力，發生Michael加成反應，破壞了TTCNPy探針的共軛，從而導致熒光猝滅(圖6b、6c)。為了進一步研究其熒光猝滅機理，對TTCNPy納米顆粒與生物硫醇反應前后的熒光壽命進行了測試。結果顯示，反應前的TTCNPy納米顆粒的熒光壽命為1.25 ns，而與Hcy、Cys和GSH生物硫醇反應后，其壽命均降低至0.78 ns左右，說明這是一個靜態猝滅的機制。

圖6 (a)在HEPES緩沖液(pH=7)中TTCNPy納米顆粒對常見氨基酸的選擇性測試，(b)TTCNPy 與生物硫醇反應機理示意圖。(c)TTCNP納米顆粒的自組裝以及檢測生物硫醇的示意圖。Fig.6 (a) Selectivity test of TTCNPy nanoparticles and common amino acids in HEPES buffer(pH=7),(b) schematic representation of the reaction mechanism of TTCNPy with biothiols.(c) Schematic diagram of self-assembly of TTCNP nanoparticles and detection of biothiols.

2.6 細胞毒性

鑒于TTCNPy納米顆粒對生物硫醇有著的良好識別功能，我們進一步通過MTT檢測法探究了TTCNPy納米顆粒的生物相容性[26]。如圖7所示，隨著納米顆粒濃度的增加，4T1細胞的存活率只有很微小的降低，在濃度高達10 μmol時，4T1的細胞存活率均可以達到95%以上。這些結果說明TTCNPy探針具有很好的生物相容性。

Concentration/μmol圖7 不同TTCNPy納米顆粒濃度下的細胞存活率Fig.7 Cell viability at different TTCNPy nanoparticle concentrations

2.7 TTCNPy納米顆粒的細胞熒光成像

通過熒光倒置顯微鏡采集經TTCNPy納米顆粒孵育的4T1細胞的熒光圖像，以驗證探針對檢測細胞內生物硫醇的能力。將4T1細胞分為A、B、C、D四組，向培養基中分別加入10 μmol的TTCNPy納米顆粒，在孵育4 h后，向B、C、D三組中再分別加入10 μmol Hcy、Cys、GSH，并繼續孵育100 min，在PBS緩沖液沖洗兩遍后，用熒光倒置顯微鏡觀察并采集細胞圖像[26]，如圖8所示，A組顯示出強烈的紅色熒光，B、C、D組只能觀察到微弱熒光，細胞成像實驗證明了生物硫醇可以有效地猝滅TTCNPy納米顆粒的熒光。

圖8 4T1細胞與僅含TTCNPy納米顆粒、 TTCNPy與Hcy孵育、TTCNPy與Cys孵育和 TTCNPy與GSH孵育后的細胞成像照片。

3 結論

本文合成并制備了一種可檢測生物硫醇的小分子TTCNPy熒光探針，進一步制備了水溶性納米顆粒。該納米顆粒具有近紅外熒光發射(λem=727 nm)，和較大的斯托克斯位移(260 nm)。能夠在pH=7的緩沖溶液中靈敏地檢測到生物硫醇，對Hcy、Cys、GSH的檢測限分別為0.479，0.429，0.480μmol?；谏锪虼贾袔€基的強親核進攻能力破壞熒光探針的共軛π鍵的原理，導致探針熒光猝滅，TTCNPy與GSH/Hcy/Cys作用后展現出明顯的熒光“開-關”的變化，從而實現對細胞中生物硫醇的可視化檢測。