氨氧化微生物及其應用于土壤污染生態(tài)毒性研究進展

高燕春張亞男王明明牟勇霖劉愛菊

(1.淄博市數(shù)字農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展中心，山東 淄博 255000;2.淄博市農(nóng)業(yè)環(huán)境暨農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，山東 淄博 255000；3.山東理工大學資源與環(huán)境工程學院，山東 淄博 255049)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人類生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的各種污染物通過不同途徑進入土壤環(huán)境，并逐漸超過土壤自凈能力，最終使土壤質(zhì)量與功能發(fā)生變化，產(chǎn)生土壤污染問題。土壤污染按污染物種類可區(qū)分為無機污染、有機污染以及復合污染。2014年全國土壤污染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，無機污染物超標點位數(shù)占全部超標點位的82.8%，其中以Cd、Zn、As、Cu等污染最為嚴重[1]。土壤有機污染則是以農(nóng)藥、抗生素、多環(huán)芳烴等污染為主。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，土壤重金屬污染與有機物復合污染已成為危及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人體健康的主要環(huán)境問題。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在推動土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，能量流動等方面具有重要作用，并且土壤微生物對土壤環(huán)境的變化極為敏感，可以作為指示土壤污染的敏感受體。多種終點指標可以被用來指示重金屬對土壤微生物群落的效應，如土壤生物量、土壤呼吸、酶活性、硝化作用和固氮等。如何選擇有效的終點指標用來開展土壤污染對土壤微生物群落毒性的評價，則是一個需要反復驗證的課題。土壤中氨氧化作用不僅是硝化作用的第1個反應步驟，也是限速步驟，是全球氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。推動氨氧化作用的氨氧化微生物，因其對重金屬污染的敏感性以及在各種環(huán)境中的廣泛分布，在指示土壤污染對微生物活性影響方面具有廣泛的應用前景。隨著人們對土壤生態(tài)功能健康與安全的日益關注，以及微生物研究手段的不斷創(chuàng)新，將氨氧化微生物應用于土壤污染生態(tài)風險分析與評估研究受到了國內(nèi)外學者的重視。

1 土壤氨氧化微生物的生態(tài)作用及其檢測技術

氮素的生物地球化學循環(huán)主要由固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用組成。其中，硝化過程分為2個階段，氨氧化為亞硝酸，稱為亞硝化反應(即氨氧化反應)，由氨氧化菌(細菌AOB和古菌AOA)完成；亞硝酸氧化為硝酸，稱為硝化反應(即亞硝酸氧化反應)，由硝酸鹽細菌完成。

最初的土壤微生物研究發(fā)現(xiàn)，氨氧化微生物在自然界中廣泛分布于各種生態(tài)系統(tǒng)中，并在地球氮循環(huán)中起著至關重要的作用。Cabcllo等研究氮循環(huán)的過程，證明AOA和AOB在硝化作用過程中起著重要的作用[2]。進一步的研究確定了氨氧化微生物參與氨氧化反應的作用機制。氨氧化菌將氨氧化生成亞硝酸鹽的過程主要分為2個反應步驟，氨在氨單加氧酶(AMO)的催化下被氧化成羥胺，再由羥胺氧化還原酶(HAO)催化氧化生成亞硝酸鹽。由于土壤中NH3的濃度很低，底物不足導致氨氧化速率緩慢，使氨氧化作用成為硝化作用中的速度控制步驟，同時在地球氮循環(huán)中起著關鍵的調(diào)控作用。此外，該生物過程對重金屬、有機物污染較為敏感，所以對氨氧化微生物功能基因的定性、定量分析可以說明污染物對土壤微生物的毒性作用。近幾年氨氧化微生物作為理想的模式微生物在土壤污染生態(tài)毒理效應研究中受到廣泛關注。

目前關于土壤中氨氧化微生物的分析，常用的檢測分析手段有潛在硝化勢、脲酶含量等，還有基于DNA方法的群落分析如聚合酶鏈式反應(PCR)技術、熒光原位雜交(FISH)技術、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)技術、變性梯度凝膠電泳(DGGE)/溫度梯度凝膠電泳(TGGE)技術等分子生物學技術的應用。

已有的研究表明，PCR、FISH、測序等技術能夠?qū)ψ匀画h(huán)境微生物的目的基因進行研究，T-RFLP技術的應用為研究微生物群落的時空分布提供了技術支持，對氨氧化微生物的深入研究有利于了解微生物參與的氮形態(tài)轉(zhuǎn)化，也是今后全球氮循環(huán)的重要研究方向。

2 氨氧化微生物對典型環(huán)境因子的響應

土壤微生物通常會對環(huán)境因子的變化表現(xiàn)出一定的適應性，然而，氨氧化細菌和氨氧化古菌對環(huán)境干擾具有較強的敏感性。因此，探究環(huán)境因子(底物濃度、溫度和pH等)對氨氧化微生物的影響已成為近些年硝化作用研究的重點。研究表明，溫度通過影響土壤中pH和含水量等理化性質(zhì)和氨氧化微生物的酶活性，間接或直接影響氨氧化微生物的相對豐度和群落結(jié)構，且AOA更能適應極端溫度環(huán)境[3]。土壤溶液的pH可以直接影響氨氧化作用的底物氨分子的存在形態(tài)，進而影響氨氧化微生物活性和群落結(jié)構。在中堿性土壤氨氧化作用主要由AOB主導[4]；而在低pH土壤中，AOB的數(shù)量相對較少活性較低，證明AOA主導酸性土壤中的硝化作用[5]。國內(nèi)外不同土壤條件下的研究都發(fā)現(xiàn)AOA的存在，因此學者推測AOA分布范圍廣泛并在極端環(huán)境中主導氨氧化作用。

上述研究表明，氨氧化微生物分布廣泛，對生態(tài)因子較為敏感。但是在進行土壤污染微生物生態(tài)毒性效應研究時，必須考慮去除其它生態(tài)因子的干擾作用。因此，收集不同自然環(huán)境下氨氧化微生物的自然波動范圍，可對污染脅迫下的氨氧化微生物響應機制及土壤污染生態(tài)效應定量描述提供更準確數(shù)據(jù)。隨著近年來微生物基因表達“正常操作范圍(Normal Operating Range)”理論的不斷成熟，將土壤NOR值引入土壤污染生態(tài)毒性效應的評估極大推動了土壤微生物對生態(tài)因子脅迫響應的定量描述研究。

3 污染土壤中氨氧化微生物研究進展

近年來土壤中單一污染和復合污染日趨嚴重，土壤污染的生態(tài)毒性效應也引起了研究者的廣泛關注。氨氧化微生物作為參與硝化過程的重要微生物，對土壤環(huán)境中的單一及復合污染存在良好的劑量效應關系，對其功能基因(amoA)的豐度和多樣性進行深入研究，可為探索污染脅迫下土壤氨氧化微生物群落動態(tài)及分布提供直接證據(jù)，以達到預測土壤環(huán)境變化和進行土壤環(huán)境管理的最終目的。

3.1 土壤中氨氧化微生物對無機污染物的響應

無機污染中以重金屬污染最為突出，因為重金屬廣泛存在于土壤環(huán)境中且易于積累，雖然微量重金屬是微生物生長代謝所必需的，但若超過一定濃度，則對微生物具有一定的毒害作用。土壤中氨氧化微生物對外界環(huán)境的變化與重金屬污染非常敏感，是反映土壤重金屬污染的微生物指標。

已有的研究證實，氨氧化微生物活性與重金屬之間存在良好的劑量效應關系，低濃度的Cd增強氨氧化微生物活性，從而提高土壤中硝化速率，增加硝態(tài)氮含量；高濃度的Cd抑制氨氧化微生物，減緩硝化作用，降低了土壤硝態(tài)氮含量[6]。而Ruyters等利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術對amoA基因進行測定，分析氨氧化微生物的群落結(jié)構變化，發(fā)現(xiàn)AOB對重金屬更為敏感，AOA對重金屬鋅和銅的耐受性較高，硝化菌群對重金屬Zn和Cu耐受性的增強與土壤污染的程度一致，證明amoA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化可以作為土壤重金屬污染生態(tài)毒性效應的指標[7]。近年來研究也表明，基于amoA基因的豐度和多樣性檢測可以揭示高濃度重金屬脅迫下氨氧化微生物群落受到嚴重抑制，并可反映長期低劑量重金屬暴露狀態(tài)下AOA和AOB的豐度和種群結(jié)構會發(fā)生顯著變化。

3.2 土壤中氨氧化微生物對有機污染物的響應

目前，土壤中典型的有機污染物主要為有機農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯(PCBs)、多環(huán)芳烴(PAHs)及抗生素，而且有機污染物對硝化作用的影響已有一些報道，但從微生物層面進行的研究較少。目前已知酸性土壤中的殺蟲劑明顯抑制硝化作用，甲胺磷能使土壤硝化作用減弱。楊玲等對除蟲菊酯類、有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、酞胺類等9種農(nóng)藥進行了研究，試驗結(jié)果表明，9種常見農(nóng)藥在不同情況下硝化勢均有不同程度的下降[8]。農(nóng)藥長期污染則會造成土壤中氨化細菌、氨氧化細菌、硝化細菌數(shù)量增加，反硝化細菌數(shù)量減少，氨化作用和硝化作用強度也隨之得到增強，說明氨氧化微生物在指示土壤有機污染的生態(tài)毒性效應方面存在良好應用前景[9]。多氯聯(lián)苯(PCBs)是首批被《斯德哥爾摩公約》列入全球控制的持久性有機污染物(POPs)之一，易與有機質(zhì)結(jié)合，造成持久污染。長期PCBs污染使土壤硝化勢顯著降低，硝化作用受到顯著抑制。多環(huán)芳烴(PAHs)指具有2個或2個以上苯環(huán)的一類有機化合物，包括萘、蒽、菲、芘等150余種化合物，是一種典型的土壤有機污染。早期研究發(fā)現(xiàn)，土壤菲污染與硝化勢之間有良好的劑量效應關系。Sverdrup等學者證實氨氧化速率對PAHs污染最為敏感，利用氨氧化速率的變化可以很好地表征土壤中PAHs[10]。進行土壤微生物分析發(fā)現(xiàn)，中等濃度(70～100μg·g-1)的芘可以嚴重影響氨氧化微生物的活性，且EC50值隨著處理時間的延長而增大[11]。因此，利用氨氧化微生物個體活性和群落多樣性進行農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴污染的毒性效應研究具有一定的可行性。

抗生素在土壤環(huán)境中濃度較低，且由于抗生素多為抗微生物藥物，在長期低水平暴露的情況下，能直接殺死環(huán)境中某些微生物或抑制其生長，威脅環(huán)境中微生物的種類、數(shù)量和群落結(jié)構，對其生態(tài)功能造成嚴重影響。探究土壤微生物對抗生素的響應機制成為國內(nèi)外學者研究重點。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星和土霉素在低濃度(0.01mg·kg-1和0.1mg·kg-1)時可刺激土壤硝化作用，但在濃度為1mg·kg-1時對土壤硝化作用產(chǎn)生抑制，而在濃度為10mg·kg-1時，強烈抑制土壤硝化作用，其中土壤硝化勢明顯受到高濃度土霉素的抑制，抑制率可達20%[12]。磺胺類抗生素低劑量施用則對土壤硝化細菌、亞硝化細菌、反硝化細菌及氨化細菌均存在激活作用，對硝化細菌的最大激活率可達1000%以上[13]。不同種類抗生素的抗菌機制可能是不同種類抗生素對土壤硝化作用影響呈現(xiàn)出不同特點的一個重要因素。已有研究采用基因水平分析得出土壤硝化微生物的群落功能多樣性隨土霉素濃度升高顯著降低的結(jié)論。探究氨氧化微生物對抗生素的響應機制不僅為土壤修復提供重要理論支持，還可完善土壤有機污染的生態(tài)風險評價，但目前相關研究僅局限于單一土壤污染，有機污染物常與其它污染物聯(lián)合作用使其毒性增強，因此對復合污染下土壤微生物的響應機理仍需進一步探索。

3.3 土壤中氨氧化微生物對復合污染物的響應

土壤復合污染通常定義為2種或2種以上的污染物在土壤中同時存在，并且每種污染物的濃度均超過國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準或已經(jīng)達到影響土壤環(huán)境質(zhì)量水平的土壤污染。對復合污染條件下，微生物對污染脅迫的反應機制進行研究更反映實際情況。如，重金屬Cd、Pb復合污染對土壤硝化作用的影響存在明顯交互現(xiàn)象，Cd起主導作用，表現(xiàn)為低質(zhì)量分數(shù)的有效態(tài)Cd對脲酶活性具有促進作用，而較高質(zhì)量分數(shù)的有效Cd表現(xiàn)為抑制作用，其原因可能是重金屬通過抑制土壤硝化微生物的生長和繁殖，減少體內(nèi)酶的合成和分泌，最后導致土壤酶活性下降[14]。國外學者以不同程度多環(huán)芳烴(PAHs)和重金屬污染的土壤作為研究對象，結(jié)果顯示，復合污染中菲對不同土壤樣品的氨氧化微生物活性的影響差別很大，其中無污染土壤中微生物活性明顯高于污染土壤；出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是土壤原有的污染物與菲相互作用的結(jié)果，增強了菲的毒性。上述研究結(jié)果表明，土壤復合污染種類繁多、作用機制復雜，土壤微生物對土壤復合污染的響應機制有待于進一步研究。

土壤抗生素與重金屬復合污染更為普遍，作用機制也更為復雜。四環(huán)素與銅的復合污染中，銅在土壤硝化過程中起主要作用，土壤硝化速率與Cu2+濃度顯著負相關，且銅在一定程度上可減緩四環(huán)素的毒性；這與四環(huán)素具有電子提供基團易與銅等二價金屬離子發(fā)生配位反應有關[15]。基因水平分析表明，恩諾沙星和鎘的復合污染對AOB-amoA基因數(shù)量的影響大于對AOA-amoA基因數(shù)量的影響，恩諾沙星對氨氧化細菌的影響隨著其濃度的增加，抑制作用越明顯，復合作用的抑制強度明顯大于單一污染處理組[16]。進一步研究表明，土霉素、恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶，這3種抗生素和Cu的單一及復合污染與氨氧化微生物amoA基因拷貝數(shù)之間存在明顯的劑量-效應關系：復合污染對AOB和AOA的毒性作用隨抗生素濃度變化而變化，其毒性強弱順序也隨之發(fā)生不同程度的變化，具體交互作用類型的變化有待研究[17]。由此可見，氨氧化微生物活性和群落結(jié)構變化可作為復合污染的預警指標，同時探究土壤微生物對復合污染的響應機制為實際修復工作提供了新的思路。

4 結(jié)論與展望

理想的生物指標應該具有可定量、敏感、特異和易于測定的特點。硝化速率對重金屬毒性比其它微生物指標更為敏感，而且可定量，易于測定，但是因硝化速率的測定受土壤環(huán)境因子的影響較大，不適合作為單一的終點指標來指示土壤污染狀況。氨氧化菌的功能基因amoA的變化可以明顯反映硝化活性的變化。通過定量PCR amoA基因的測定，確定環(huán)境中氨氧化細菌的種群大小和群落結(jié)構變化，可以說明污染物對環(huán)境微生物的毒性作用。近期研究表明，氨氧化微生物amoA mRNA水平對氨氧化活性的變化非常敏感，可以作為土壤中氨氧化活性的生物指標。硝化速率與這些指標結(jié)合在一起，可以更全面準確地確定污染物對土壤的生態(tài)毒性水平信息。

到目前為止，氨氧化微生物在土壤重金屬污染的毒性評價中具有的作用己經(jīng)毋庸置疑，而對氨氧化作用及采用氨氧化微生物各種生理特征為指標對土壤復合污染進行的研究并不是很多，隨著微生物在土壤污染毒性評價越來越受到人們的重視，這方面的研究也有很多需要開展的工作。