細菌整合子檢測方法研究進展

郝佳慧， 楊澤華

（1.山西醫科大學第一臨床醫學院，山西 太原 030001；2.山西醫科大學第一醫院檢驗科，山西 太原 030008）

20世紀80年代，澳大利亞學者在研究耐藥質粒和轉座子的過程中發現了整合子，并于1989年首次報道，他們認為整合子是一種新的抗性決定基因[1]。1991年，HALL等[2]提出整合子-基因盒系統概念，認為整合子-基因盒系統介導了微生物對多種抗菌藥物的耐藥。目前，約有130個不同的基因盒已經被鑒定出來，且大部分基因盒都在抗菌藥物耐藥性方面起到了一定作用。整合子是一個可移動的遺傳元件，其基本組件包括整合酶基因intI、重組位點attI和啟動子Pc。在抗菌藥物選擇壓力下，整合酶基因編碼整合酶蛋白切除和整合耐藥基因盒，使耐藥基因盒插入到重組位點attI，啟動子Pc啟動耐藥基因盒的轉錄與后續表達，使細菌獲得耐藥性。在其他選擇壓力下，整合子還可以捕獲不同功能的基因盒，在細菌基因組進化中也發揮著重要作用。所以，盡早判斷細菌是否攜帶整合子，可以更好地掌握細菌的耐藥情況。確定細菌中的整合子一般是通過檢測整合子的整合酶基因和可變區基因盒，主要檢測方法包括基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）的各種方法、環介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、宏基因組測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）、基因芯片等分子生物學方法。本文對上述方法和非典型1類整合子檢測方法的原理、特點和應用進行介紹，為臨床實驗室準確檢測細菌中的整合子，預判細菌耐藥提供參考。

1 基于PCR的整合子檢測

1.1 常規PCR

PCR技術是模擬DNA的天然復制過程，通過變性、退火、延伸3個步驟來擴增特定的DNA片段的一種方法，每完成1個循環需要2～ 4 min，2～3 h就能將待擴增目的基因擴增幾百萬倍。基于PCR擴增技術的原理，可根據整合酶基因設計引物，選擇合適的擴增條件擴增整合酶，從而判斷整合子的攜帶情況[3]。除此之外，PCR可以通過擴增整合子可變區來檢測整合子，針對5'-CS和3'-CS之間含有抗性基因盒的內部可變區設計特異引物，并進行擴增，鑒定細菌中的整合子[4]。2001年，KOELEMAN等[5]對采用PCR技術擴增整合酶和整合子可變區這2種方法進行了比較，發現整合酶基因的PCR檢測與整合子可變區PCR檢測相比，可多檢測到2個整合子，原因可能是細菌的整合子可變區不攜帶基因盒，或者攜帶的基因盒數量超過了PCR的擴增能力，從而造成整合子的漏檢。提示整合子PCR通過擴增可變區檢測整合子可能造成假陰性。因此，整合酶PCR檢測似乎是一種快速而簡單的方法，可以用于常規篩查細菌中的整合子。目前，大部分細菌整合子的檢測主要是通過PCR擴增整合酶基因，對擴增陽性的菌株再進行可變區基因盒的擴增，然后對可變區陽性菌株進行測序，得到基因盒具體序列和排列順 序[6-10]，從而發現新的耐藥基因盒。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（r e a ltime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）

RT-qPCR是把熒光染料或探針加入反應體系中，通過熒光信號對PCR進程進行實時監測，記錄每個循環后擴增產物量的變化，最后通過循環閾值和標準曲線對未知模板進行定量分析。2017年，車潔等[11]利用小溝結合物（minor groove binder，MGB）探針標記技術，將intI基因和ISCR1元件的檢測融合到1個擴增反應體系中，建立了一套雙元件二重RT-qPCR方法，可在1個反應管里同時檢測intI基因和ISCR1元件這2種多藥耐藥相關基因，且僅需40 min，檢測靈敏度均在101拷貝/μL數量級。BARRAUD等[12]對引物-探針定量PCR檢測整合子的方法進行了驗證和評估，發現每對引物-探針對相應的intI基因都是特異的，不含整合子的菌株和含超級整合子的弧菌菌株均未獲得信號，所有含有整合子的菌株均獲得了特異性擴增信號；他們還發現，熒光定量PCR可以準確測出模板的濃度，而普通PCR只能對模板進行定性或半定量測定；熒光定量PCR比普通PCR檢測細菌中整合子耗時更短，可免去凝膠電泳成像過程，快速檢測整合子，非常適合用于對大量多重耐藥細菌整合子的初篩。

1.3 多重PCR

多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，是在同一反應體系中加入最少2對引物，可同時擴增多個核酸片段，其反應原理和過程與普通PCR類似，一般使用多重PCR技術在1個PCR體系中加入1、2和3類整合酶基因的上、下游引物，檢測細菌是否存在1、2和3類整合子[13]。TEWARI等[14]針對intI 1、intI 2和intI 3整合酶基因設計引物，通過多重PCR檢測78株大腸埃希菌攜帶整合子的情況，發現有1株同時含有2類和3類整合子。劉旭等[15]為了建立一種能同時檢測1類整合子、4類超級整合子和1型插入序列共同區的多重PCR檢測方法，設計了3對特異性引物，還通過對單引物靈敏度檢測和退火溫度的不斷測試，優化了引物最佳濃度和最佳退火溫度。引物是影響多重PCR目的片段成功擴增的關鍵，不同的引物在同一PCR體系中靈敏度不同，彼此會形成一種競爭關系，可能會互相抑制。因此，對不同基因引物濃度的選擇至關重要。目前，檢測整合子的方法多為單基因PCR檢測，即檢測1種整合酶基因[16]。然而，單基因PCR檢測可能會造成漏檢，特別是當有2種或2種以上整合酶基因同時存在時；且單基因PCR檢測成本高、耗時長；而多重PCR可以同時擴增多個基因，克服了單基因PCR的缺點，從而縮短了檢測時間，降低了成本。

1.4 簡并聚合酶鏈反應（degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction，DOP-PCR）

DOP-PCR是根據遺傳密碼具有簡并性設計簡并引物，然后進行PCR擴增，一般是根據整合酶基因的保守序列設計1、2和3類整合酶基因的簡并引物，檢測細菌攜帶的3類整合酶基因，并使用限制性核酸內切酶對PCR產物進行酶切分析，根據酶切片段的大小來判斷所攜帶整合酶的類型[17]。有研究者設計了DOP-PCR引物hep35和hep36進行PCR擴增，用于篩查53株志賀菌中的1、2和3類整合子[18]。DOP-PCR可以同時檢測1、2和3類整合酶基因[19-20]，縮短了檢測時間，也降低了檢測成本。雖然DOP-PCR簡化了實驗過程，但擴增產物仍需酶切和電泳技術才能確定分類[18]。簡并引物的設計決定了PCR能否成功擴增，這一方法本身有一定的偶然性，反應條件尚需摸索，且DOP-PCR對模板也有一定要求，若模板具有很高的GC含量，經常會擴增出許多不正確片段，造成檢測結果的偏差。

2 LAMP

LAMP是NOTOMI等[21]2000年開發的一種新的恒溫核酸擴增方法，是針對靶基因的6個區域設計4種特異性引物，包括2條內引物和2條外引物，在恒定溫度（65 ℃）條件下，通過一種鏈置換DNA聚合酶進行核酸擴增。2018年，CHEN等[22]優化了高通量LAMP技術，并將其應用于整合子和耐藥基因盒的檢測，針對整合子上的intI 1、intI 2、intI 3和基因盒特定序列設計了內引物和外引物，僅耗時2.5 h。LAMP僅需在水浴和加熱塊等簡易設備上分別進行加熱和擴增，然后將擴增產物用SYBR Green染色，這使得實驗結果僅通過觀察顏色變化即可判定，大大簡化了判斷結果的步驟，節省了時間[23]。有學者篩選出1、2、3類整合子的特異性保守序列，設計了LAMP引物組，采用多重LAMP方法檢測細菌中的整合子，結果顯示，1類整合子陽性比例最高，其次是2類整合子，未檢測到3類整合子，也未發現1類和2類整合子均為陽性的菌株[24]。然而，多重LAMP方法與多重PCR技術一樣，在引物設計上更為復雜，同時要避免不同引物間的互相競爭導致的抑制作用，所以限制了多重LAMP方法的進一步應用。普通PCR需要經過熱循環來擴增，擴增產物還需通過凝膠電泳驗證[25]；LAMP技術可以在恒溫條件下實現擴增，不需要進行模板的預變性，不需要昂貴、精密的儀器，簡化了實驗過程，節約了實驗成本。因此，LAMP方法可以用于大規模臨床分離株整合子的快速篩查。

3 基因測序技術

基因測序是為了獲得目的DNA片段的全部堿基序列，在分子生物學和基礎醫學領域應用廣泛，目前已經發展到第4代，第2代、第3代和第4代測序技術統稱為下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術。第1代測序技術主要基于Sanger雙脫氧終止法的原理，要將提取的樣品打碎成DNA片段，最后通過凝膠電泳獲得序列，2次只能獲得1條長度為700～1 000個堿基的序列，通量低、成本高。第2代測序也被稱為高通量測序（high-throughput sequencing，HTS），有許多測序平臺，1次可對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定，通量高、成本低，已被廣泛用于檢測細菌中的整合子。有學者在巴西不同地區醫院的患者身上收集了21株含KPC-KP基因的肺炎克雷伯菌，從中篩選出10株進行全基因組測序（whole genome sequencing，WGS），再利用GenBank數據庫中已存入的1、2和3類整合子的整合酶基因與測得的基因序列進行比對，最后得到的WGS數據中顯示有9株肺炎克雷伯菌含有1類整合子和不同的基因盒[26]。除此之外，CURY等[27]制作了一個名為IntegronFinder的程序，在全基因組序列中檢索，能夠準確、靈敏地識別整合子。IntegronFinder能夠檢測細菌基因組中的整合子和整合子相關結構[28]，且通過測序技術可以獲知細菌中整合子基因盒的具體種類和序列，進而掌握細菌耐藥的新進展[29-31]。隨著NGS技術的快速發展，測序成本變得越來越低，臨床和實驗室逐漸開始大量采用測序技術解決問題。

4 非典型1類整合子的檢測方法

典型的整合子系統包括3個部分，2端是一段高度保守序列，即5'-CS和3'-CS，5'-CS和3'-CS之間的區域即可變區，其間可插入不同數量的基因盒，但基因盒并非整合子的必需組成部分。1類整合子通常通過5'-CS和3'-CS設計引物，以擴增整合子的可變區[32]。然而，一般非典型1類整合子3'-CS結構異常，所以非典型1類整合子用標準引物可能無法擴增出復雜的基因盒序列。反向PCR可擴增1段已知序列兩端的未知序列，擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成1個環狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段。LEE等[33]設計了intI 1和sul 1基因的反向引物，對基因組DNA進行反向PCR分析和DNA測序，在霍亂沙門菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌中分別檢測到3個異常結構——sul3相關突變整合子、缺陷型1類整合子和qnrB2相關復合體1類整合子。XIAO等[34]使用引物對INTRR和INTRF對96株1類整合子陽性菌株基因組DNA進行反向PCR分析，然后通過電泳和測序進行驗證，檢測到常規不能擴增的非典型1類整合子的5個可變區。以上研究均證實逆轉錄PCR可以用來檢測含有非典型3'端的整合子，從而減少整合子的漏檢，全面了解整合子的各種分型。但是，反向PCR技術的難點是需要從許多酶中選擇合適的限制酶，才能酶切到合適的DNA片段。

5 其他檢測方法

基因芯片技術是通過與一組已知序列的核酸探針雜交來檢測核酸序列，可以快速得到所測DNA碎片的基因序列。GLENN等[35]使用結合和固定在基質上的整合子特異性寡核苷酸探針，發現29個陽性雜交產生目標DNA-探針雙鏈，陽性雜交與PCR分析結果一致。沈瀚等[36]還開發了菌落原位雜交法，用于檢測整合子，他們制備1類整合酶基因的特異性探針，利用細菌自身的繁殖對靶序列進行擴增，檢測革蘭陰性菌中的Ⅰ類整合酶基因。但菌落原位雜交法實驗周期比較長，程序比較繁雜，影響因素也較多，因此未被廣泛使用。

6 總結

在抗菌藥物的選擇壓力下，耐藥細菌的存活增加了細菌的毒性和致病性，嚴重影響了人類的健康。細菌整合子檢測方法的研究對于早期發現整合子具有重大意義，可盡早判斷細菌的進化方向。了解細菌整合子不同檢測方法的優點和不足，可幫助臨床實驗室根據樣本量和檢測目的選擇合適的方法。細菌整合子檢測方法的研究不僅需要關注其特異性，還要考慮檢測時間和成本等問題，包括其能否與試紙或試劑盒等結合，從而可以大批量檢測整合子，增加實用性。為此，臨床實驗室應積極探索整合子的檢測方法，及時發現或避免新型耐藥表型的出現。