神經鞘脂代謝與鐵死亡在肝癌中的研究進展

王俊楠 金俊飛

1桂林醫學院附屬醫院廣西肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室，桂林 541001；2桂林醫學院附屬醫院廣西神經鞘脂代謝相關疾病基礎研究重點實驗室，桂林 541001；3桂林醫學院中美健康與疾病脂質研究中心，桂林 541001；4桂林醫學院附屬醫院肝膽胰外科實驗室，桂林 541001

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥相關死亡中排在第4位，每年新發肝癌占癌癥病例的4.7%，肝癌導致的死亡人數在腫瘤致死中占比8.3%［1］。絕大多數肝癌的病理類型為肝細胞癌，占比約90%。早期發現的肝癌通過手術治療，能達到較好的治療效果，但是大多數肝癌患者在中、晚期才被確診，失去手術治療機會，預后較差。探索肝癌生物學特征，發現更有效的治療方案仍應為肝癌研究的重要方向。近期研究發現肝癌細胞對鐵死亡激動劑敏感，而鐵死亡激動劑能引起神經鞘脂代謝通路的改變。但是肝癌、鐵死亡、神經鞘脂代謝三者的關系依舊不太明朗，鐵死亡、神經鞘脂代謝對肝癌診斷、治療等方面的影響也不清楚，本綜述就相關方面進行討論。

神經鞘脂代謝通路與鐵死亡通路概述

1、神經鞘脂代謝通路概述

從 1986 年 Hannun 等［2］首次報道神經鞘脂分子可以作為信號分子以來，經過30 余年的研究，神經鞘脂分子及代謝酶在細胞生物過程中的作用也逐漸被認識。神經鞘脂既是細胞膜中必不可少的結構分子，也是參與多種細胞功能的第二信使，在細胞穩態、細胞凋亡等生物功能調節中起重要作用。神經鞘氨醇（sphingosine，Sph）和神經酰胺（ceramide，Cer）及其磷酸化形式神經鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1 phosphate，S1P）和 神 經 酰 胺 -1- 磷 酸（ceramide-1 phosphate，C1P）是細胞生理活動及病理過程的重要調節因子，其中S1P 和C1P 也是影響Cer 水平的重要調控因子，但其作用不盡相同。Cer 調控細胞周期、誘導細胞凋亡，而C1P 則促進細胞增殖。Cer作為神經鞘脂代謝通路的中心，主要來源于從頭合成和補救合成途徑，兩者均發生于內質網。Cer 從頭合成途徑是在3-酮二氫神經鞘氨醇還原酶、絲氨酸棕櫚酰轉移酶和（二氫）神經酰胺合成酶（ceramide synthases，CerS）的協同作用下，將胞質中L-絲氨酸和棕櫚酰輔酶A 轉化為二氫神經酰胺（dihydroceramides，Dhcer），Dhcer 在二氫神經酰胺去飽和酶作用下插入雙鍵形成 Cer；Sph 可以在 CerS 催化下生成 Cer，Cer 通過神經酰胺酶分解為Sph，Sph 和S1P 之間又可以通過神經鞘氨醇磷酸酶、神經鞘氨醇激酶相互轉化，S1P 可進一步分解為乙醇胺磷酸和脂肪醛；此外，神經酰胺還可以通過神經鞘磷脂、鞘糖脂的分解以及C1P的去磷酸化產生［3］。

2、鐵死亡相關信號通路概述

鐵死亡（ferroptosis）由二價鐵離子積累引起致命的脂質過氧化作用驅動，可以通過阻斷脂質過氧化、消耗二價鐵離子來抑制鐵死亡，鐵死亡屬于程序性細胞死亡。含多不飽和脂肪酸磷脂［polyunsaturated fatty acid-containing phospholipids（PLs），PUFA-PLs）］的合成和過氧化、鐵代謝失衡是鐵死亡的先決條件，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）- 還 原 性 谷 胱 甘 肽（reduced glutathione，GSH）系 統 、鐵 死 亡 抑 制 蛋 白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）-泛素醌（ubiquinol，CoQH2）系統、二氫乳清酸脫氫酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）-CoQH2 系 統 、GTP 環 水 解 酶1（GTP cyclohydrolase 1，GCH1）- 四 氫 生 物 喋 呤（tetrahydrobiopterin，BH4）系統是目前已知的對抗鐵死亡的主要防御系統［4］。

2.1、PUFA-PLs 的合成和過氧化 脂質過氧化的累積導致細胞膜脂質雙分子層不可逆損傷，直接導致細胞鐵死亡的發生。多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）在游離狀態下不進行脂質過氧化。PUFAs 與膜磷脂（phospholipids，PLs）結合后形成 PUFA-PLs，PUFA-PLs的產生和過氧化是鐵死亡發生的必要條件。因此，催化PUFAs 和磷脂結合的酶在鐵死亡中起重要作用。乙酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4 和溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3 是PUFA-PLs 合成的關鍵酶，兩者的失活可以阻斷或減弱鐵死亡［5］。脂加氧酶（lipoxygenases，LOXs）可催化定向聚合氧化PUFAs，導致脂質過氧化［6］。單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）缺乏雙烯丙基，不容易被過氧化，MUFAs 取代PLs 中的PUFAs 能夠抑制細胞膜脂質過氧化和鐵死亡。硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 和長鏈脂酰輔酶A合成酶3作為MUFA-PLs的合成酶，它們失活可以增加癌細胞對鐵死亡的敏感性［7］。

2.2、鐵代謝調節 從命名來看，鐵死亡與鐵有關，但是鐵離子在鐵死亡中的作用仍有待深入研究。生理條件下，細胞的鐵吸收主要由轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）控制，鐵結合到轉鐵蛋白后被受體介導的內吞作用轉入細胞。這一過程可以通過敲除TFR1來阻斷，進而抑制鐵死亡激動劑誘導的細胞死亡［8］。鐵蛋白是鐵離子貯存蛋白，減少鐵蛋白的表達，尤其是鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain 1，FTH1）的表達，會增加不穩定的鐵池，使細胞對鐵死亡更敏感［9］。Gao 等［10］提出鐵死亡是一種細胞自噬性死亡過程，通過自噬降解FTH1可以促進鐵死亡，FTH1降解導致細胞游離鐵離子增加，游離鐵離子增加促進細胞鐵死亡［11］。另外，在鐵死亡過程中依賴鐵的酶可能起到關鍵作用，比如最近有研究證明細胞色素P450 氧化還原酶是鐵死亡期間脂質過氧化的促進因子。

2.3、GPX4-還原型谷胱甘肽（GSH）系統 GPX4 能利用GSH 催化還原H2O2或有機氫過氧化物生成水或相應的醇，其家族成員GPX4 是首個被發現的鐵死亡抑制蛋白，GPX4可以作為磷脂氫過氧化物酶，將脂質過氧化氫還原為脂質醇，阻止鐵依賴的脂質活性氧（lipid reactive oxygen species，L-ROS）的形成、積累，從而維持細胞內脂質穩態，阻止脂質氧化，防止鐵依賴的細胞死亡模式“鐵死亡”的發生［12］。GSH 是 GPX4 抑制 ROS 生成的重要輔因子，Erastin通過抑制胱氨酸谷氨酸反向轉運體，減少胱氨酸進入細胞，降低細胞內GSH 水平，GPX4 活性下降，導致鐵死亡發生。此外，共價小分子物質RSL3可以通過抑制GPX4酶活性，誘導鐵死亡的發生。總之，隨著鐵死亡研究的深入，GPX4 在鐵死亡發生過程中的作用及機制逐漸被認識，GPX4已經成為鐵死亡檢測的標志物。

2.4、FSP1 FSP1 定位于質膜，是一種 NADP 依賴的氧化還原酶，能將輔酶Q（coenzyme Q，CoQ）還原為CoQH2，后者可以通過捕獲脂質過氧自由基從而抑制脂質過氧化導致的鐵死亡［13］。FSP1 屬于非線粒體CoQ 抗氧化系統，和GPX4 一樣，是阻止鐵死亡的關鍵蛋白。FSP1-CoQ10-NAD（P）H 途徑與 GPX4-GSH 系統協同抑制磷脂過氧化和鐵死亡［13］。

2.5、DHODH DHODH 位于線粒體內膜，參與嘧啶的合成，可將線粒體內膜中的CoQ 還原為CoQH2，減少線粒體脂質過氧化，抑制鐵死亡。在GPX4 高表達的癌細胞中，鐵死亡誘導劑引起線粒體脂質過氧化和鐵死亡過程中DHODH 失活參與其中，起協同作用；在GPX4 低表達的癌細胞中，DHODH 失活誘導大量線粒體脂質過氧化和鐵死亡。DHODH 底物和產物對鐵死亡的影響產生相反的效果，DHODH 獨立于 GPX4 和 FSP1，通過 DHODH-CoQH2系統發揮抗鐵死亡作用［14］。

2.6、GCH1-BH4 系統 BH4 能捕獲脂質過氧自由基，是抗氧化系統的組成部分，參與一氧化氮、神經遞質和芳香族氨基酸的代謝。GCH1 是BH4 的第一限速酶，通過生成BH4 捕獲自由基起抗氧化作用，并通過GCH1 介導的CoQH2抑制鐵死亡。最新研究發現，在結直腸癌中GCH1/BH4 能抵抗鐵死亡，抑制GCH1/BH4 能激活噬鐵蛋白促進Erastin誘導的鐵死亡［15］。

神經鞘脂代謝通路與鐵死亡通路的交互關系及對肝癌的影響

1、神經鞘脂代謝信號通路與肝癌

神經鞘脂在調節細胞增殖、對化療藥物的反應以及癌癥預防中發揮重要作用［16］。隨著神經鞘脂代謝分子及代謝酶研究的深入，其在腫瘤發生、發展及治療中的作用逐漸被了解，特別是神經鞘脂代謝紊亂對肝癌的影響。肝癌組織和癌旁正常組織相比，神經鞘脂水平發生明顯變化。Krautbauer 等［17］的研究發現，Cer 作為神經鞘脂代謝中心分子，在肝癌組織中明顯減少；特異性提高癌細胞Cer水平，能引起肝癌細胞死亡，可能是治療肝癌的潛在方法。Funaki等［18］的數據表明神經鞘氨醇激酶 1（sphingosine kinase 1，SPHK1）在肝癌發生中起重要作用，在小鼠敲除SPHK1基因可以明顯減少DEN 誘導的肝臟腫瘤生成。Miura 等［19］的研究表明，S1P 參與肝癌侵襲，在腫瘤進展中起重要作用，SPHK1 的表達水平與腫瘤大小有關。肝癌組織中S1P、Cer水平較癌旁正常組織明顯升高。另外，S1P通過S1P受體降低肝細胞生長因子誘導的肝癌細胞遷移。堿性神經酰胺酶2（alkaline ceramidase 2，ACER2）是神經鞘脂代謝中影響細胞Cer 產生的關鍵酶，ACER2 可以通過酸性神經鞘磷脂酶（sphingomyelinase，SMase）樣磷酸二酯酶3B 促進肝癌細胞存活和遷移［20］。類似研究認為堿性神經酰胺酶3（alkaline ceramidase 3，ACER3）可促進肝癌細胞增殖，抑制ACER2、ACER3 可能成為肝癌治療的新思路。總之，隨著研究的深入，靶向神經鞘脂代謝中間產物、代謝酶的干預措施有望在肝癌治療中取得突破。

2、鐵死亡信號通路與肝癌

越來越多的證據提示，鐵死亡與腫瘤相關。索拉菲尼（sorafenib）作為多種致癌激酶的抑制劑，是肝癌靶向治療的一線藥物。研究證明索拉菲尼可誘導肝癌細胞發生鐵死亡。Erastin 和索拉菲尼通過誘導鐵死亡、抑制肝癌中核因子紅細胞系2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）的表達和活性來發揮抗癌作用。視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）和金屬硫蛋白-1G（metallothionein-1G，MT-1G）是Nrf2 的負調控因子，與肝癌密切相關。索拉菲尼治療肝癌導致pRb 水平下降、線粒體ROS 水平增高、鐵死亡發生率增加。Sun 等［21］研究發現，敲除MT-1G 導致GSH 消耗和脂質過氧化水平顯著增加，從而促進索拉非尼誘導肝癌細胞鐵死亡的發生。研究表明，谷胱甘肽S-轉移酶ζ1（glutathione S-transferase zeta 1，GSTZ1）通過抑制NRF2/GPX4 軸增強了索拉非尼誘導肝癌細胞鐵死亡。索拉非尼與GPX4抑制劑RSL3聯合治療可能是一個有前途的肝癌治療策略。Gao 等［22］發現：Hipo-Yes 相關蛋白/含有PDZ 結合基序的轉錄共激活因子（Yes-associated protein/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，YAP/TAZ）可以誘導溶質載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）的表達；同時，YAP/TAZ 能維持轉錄激活因子4 的蛋白穩定性、核定位和轉錄活性，進而協同誘導SLC7A11 的表達；SLC7A11 是維持細胞內谷胱甘肽穩態的關鍵轉運蛋白，SLC7A11表達能抑制鐵死亡，導致索拉菲尼耐藥。Sun 等［23］研究證實，p62-Keap1-NRF2 通路上調鐵代謝、ROS 代謝的多個相關基因比如醌氧化還原酶1、血紅素加氧酶1 和鐵蛋白重鏈1 等在肝癌細胞抵抗鐵死亡中發揮重要作用。

3、神經鞘脂代謝與鐵死亡的關系

Cer作為神經鞘脂代謝通路的中心分子，通過影響重要效應分子發揮抑制腫瘤、對抗細胞增殖的作用，參與細胞凋亡、衰老和壞死等過程。已經證明，Cer 在多種細胞毒性藥物和其他抗癌藥物激發的自噬過程中發揮關鍵作用［24］。2016 年 Yang 等［25］的 研 究 發 現 哌 嗪 Erastin 處 理 導 致HT-1080 細胞 Cer 明顯升高。Thayyullathi 等［26］研究發現不同的鐵死亡誘導劑如RSL3 和FIN56 處理HT-1080 和Calu-1細胞后，Cer顯著積累，提示在鐵中毒過程中Cer積累不依賴于鐵死亡誘導劑本身。Niu 等［27］研究發現對乙酰氨基酚誘導肝細胞鐵死亡過程中Cer 含量發生變化，提示Cer可能參與其中。

在SMase 的作用下水解神經鞘磷脂（sphingomyelin，SM）生成Cer 是Cer 產生的主要來源之一，SMase 根據最適pH 分為酸性、中性、堿性3 類。中性神經鞘磷脂酶（neutral SMase，NSMase）和酸性神經鞘磷脂酶（acid SMase，ASMase）是Cer 產生的主要貢獻者。NSMase 包含NSMase-1、NSMase-2、NSMase-3 和線粒體相關NSMase 4 種。我們團隊研究發現：NSMase-1 在肝癌組織中低表達，SM/Cer 比值升高；NSMase-1 表達水平與肝癌預后相關，NSMase-1 高表達肝癌患者預后較好，NSMase-1 可能通過促進SM 水解生成 Cer 來 抑 制 肝 癌 的 進 展［28］。 ASMase 可 分 為 溶 酶 體ASMase 和分泌型 ASMase［29］。大量研究表明，在正常生理和許多常見疾病（包括腫瘤）的病理生理過程中ASMase 起重要作用，ASMase 可能是治療腫瘤的重要靶點。最近研究顯示，敲低ASMase 基因或藥物抑制ASMase 可以減弱Erastin 誘導的自噬、GPX4 降解和脂質過氧化，從而減少Erastin 介導的鐵死亡。ASMase 基因激活增加不同鐵死亡誘導劑（ferroptosis inducer，FIN）處理引起的癌細胞鐵死亡，ASMase在鐵死亡過程中起關鍵作用［26］。

另外，近期有究表明腦出血誘導的SPHK1 表達促進鐵死亡介導的繼發性腦損傷，在這一可能致死的過程中SPHK1起關鍵作用［30］。該發現從側面證實了神經鞘脂代謝與鐵死亡存在密切關聯。

總結與展望

PUFA-PLs的合成和氧化、鐵代謝失衡是鐵死亡發生的激發/促進因素和前提條件，對抗鐵死亡的防御系統主要是由 GPX4、DHODH、FSP1、GCH1 等參與的抗氧化系統。激發/促進鐵死亡發生的因素和對抗/防御鐵死亡系統的失衡，將導致致命性過氧化物在細胞膜的堆積，進而引起鐵死亡的發生。腫瘤具有獨特的代謝特點，包括高負荷的活性氧和鐵死亡防御系統關鍵蛋白的表達水平發生變化，導致腫瘤對鐵死亡激動劑敏感，鐵死亡相關信號分子有望成為腫瘤治療的新靶點。已經有研究表明：鐵死亡激動劑Erastin處理可以激活ASMase、引起神經酰胺生成增加、參與ROS生成和脂質過氧化，提示神經鞘脂代謝通路中的關鍵分子和/或代謝酶在鐵死亡過程中起重要作用。雖然現有的研究表明神經鞘脂代謝通路與鐵死亡存在關聯，但兩者的交互作用及具體機制仍不清楚，特別是兩者的交互作用在肝癌研究方面還很少，加強這方面的研究，有助于從“神經鞘脂代謝通路-鐵死亡”這一獨特視角解釋肝癌發生、發展的機制，為肝癌治療找到新方案。