補腎復方在絕經后骨質疏松癥動物模型中的研究進展*

尹 航，董 博，康武林，袁普衛，劉德玉

（1.陜西中醫藥大學第一臨床醫學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000）

骨質疏松癥（osteoporosisi，OP）是一類以單位骨量減少、骨微結構破壞為特征，導致骨的脆性增加、易于發生骨折的全身性代謝骨病[1]。絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是絕經后女性卵巢功能減退，體內雌激素水平下降，成骨細胞活性減弱，破骨細胞活性加強，骨吸收大于骨形成，使骨代謝呈現高轉換型而形成的代謝性骨骼疾病[2]?，F代醫學主要使用抗吸收藥、合成代謝藥及骨礦化藥等藥物抑制破骨過程、維持骨結構、延緩疾病進展，但其存在不良反應較大、患者耐受度低、安全性和有效性尚不理想等不足。補腎復方治療本病療效確切，副作用小，患者接受程度高，應用前景廣闊?，F總結補腎復方在絕經后骨質疏松癥動物模型中的實驗研究進展，為補腎復方的臨床應用推廣提供參考。

1 絕經后骨質疏松癥的中醫學認識

中醫學認為，PMOP歸屬“骨痿”“骨極”“骨枯”等范疇。《素問·痿論篇》中記載：“五藏使人痿……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿。”本病與腎關系密切，腎精充足，則骨髓化生有源，筋骨勁強，關節滑利；腎精不足，則骨髓化生無源，腰脊不舉，骨枯而痿?！鹅`樞·決氣》記載：“谷入氣滿，淖澤注于骨，骨屬屈伸，泄澤，補宜腦髓，皮膚潤澤?！焙筇炱⑽傅墓δ芘c骨骼的正常生長密切相關，脾氣健旺得以維持骨的正常功能?！鹅`樞·本臟》中記載：“是故血和則經脈流行，營復陰陽，筋骨勁強，關節清利矣?！睔庋溆c骨骼強健緊密相關，氣血充盈則筋骨強。由此可見，本病屬本虛標實之證，以腎虛、脾虛為本，血瘀為標，對于本病的治療多以補腎為主，兼以強筋壯骨、健脾養血、活血祛痰。臨床上應用的補腎復方制劑如二仙湯[3]、更年骨堅方[4]、六味地黃丸[5]及補腎藥膳[6]等治療效果顯著，對骨生長、骨密度及疼痛癥狀等均有一定的改善。

2 絕經后骨質疏松癥動物模型

絕經后骨質疏松癥動物模型是動物體內雌激素水平下降，導致骨吸收增強、骨丟失過多而引起的骨質疏松癥。目前造模常用的實驗動物有大鼠、小鼠、兔、羊及非人類靈長類動物等，在實驗動物選擇中常以雌激素缺乏導致的骨質疏松動物模型作為首選。由于大鼠具有成本低廉、易于飼養、短時間內可達到新的骨改建動態平衡、骨代謝特點與絕經后女性骨質疏松相似、模型穩定及實驗結果可信度高等特點，故大鼠目前被廣泛應用于PMOP的研究[7-8]。目前PMOP動物模型常用造模法大體可分為兩類：手術去勢法和藥物去勢法。而手術去勢法中的雌性動物雙側卵巢切除是PMOP最常用的造模方法[9]。

2.1 手術去勢法 手術去勢法是指利用外科手術方法將動物生殖系統切除，使其功能喪失以達到動物模型建立的方法。1969年SAVILLE P D.[10]首次通過外科手術切除雌性大鼠卵巢成功建立了PMOP模型。邱宇等[11]通過研究去卵巢小鼠術后不同時期骨微結構的動態變化，證實去卵巢法可成功制備出PMOP模型，且發現小鼠在去卵巢術后1周至1個月松質骨微結構明顯受損，早于皮質骨骨化。

2.2 藥物去勢法 藥物去勢法是在不切除動物生殖系統的情況下，通過給予動物抑制雌激素分泌的藥物從而模擬絕經后狀態，使體內雌激素水平降低，達到骨量丟失等骨質疏松癥狀的造模方法。目前常用的藥物有促黃體激素釋放激素受體激動劑、雌激素受體拮抗劑、非甾體類雄激素拮抗劑等。此造模法具有無創傷、不產生干擾檢測的電解質紊亂及不激發動物手術應激反應等優點，但由于各類藥物的副作用，實驗結果可信度不高，相較于手術去勢法其應用范圍明顯受限。

雖然絕經后骨質疏松癥動物造模方法有很多，而手術去勢法造模具有造模率高、穩定性好、造模周期短的特點，因此成為PMOP的經典造模方法。

3 補腎復方在絕經后骨質疏松癥動物模型中的研究

3.1 免疫調節作用 T細胞是重要的免疫調節細胞，同時也是骨吸收的重要調節因子。最新發現的兩種T細胞亞群即輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）與調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）在維持成骨與破骨細胞的平衡中發揮了重要的作用。PMOP患者體內雌激素水平下降，使免疫系統“輔助手”（cluster of differentiation 4+，CD4+）T細胞產生更多的Th17，從而出現Th17偏移。Th17產生的炎癥因子白細胞介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）可誘導破骨細胞形成，從而引起骨量丟失[12]。Treg可產生白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）炎癥抑制因子，可抑制Th17效應因子，從而起到抑制骨吸收的作用[13]。劉金勇等[14]研究發現龜鹿補骨方可降低去卵巢大鼠血清中白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平，而升高IL-10水平，表明龜鹿補骨方可調節Th17、Treg及相關因子的表達，逆轉Th17/Treg失衡狀況，防治PMOP。

3.2 對激素或細胞因子的調節作用 多種細胞因子在PMOP疾病發生發展過程中起著重要的作用。血清生長激素（growth hormone，GH）和胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）是調節骨平衡的重要因素，主要表現為維持骨量。蘇海容等[15]通過給去卵巢大鼠灌胃補腎壯骨顆粒，發現補腎壯骨顆?？商岣呷ヂ殉补琴|疏松癥大鼠血清GH和IGF-1水平，在防止骨量丟失的同時增加骨密度。IL-17和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是PMOP疾病進展中的重要促炎因子。劉立萍等[16]通過觀察補腎填精方左歸丸對PMOP模型大鼠炎癥因子的影響，發現補腎填精方可明顯降低大鼠血清IL-17、TNF-α水平，從而有效防治PMOP。

3.3 抑制骨吸收和促進骨形成作用 PMOP主要表現為骨量減少和骨微結構破壞，骨代謝的平衡取決于骨形成和骨吸收之間的動態平衡。當骨吸收大于骨形成時，導致骨微結構紊亂的因素均會促進骨質疏松癥的發生。細胞核因子κΒ受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κΒ ligand，RANKL）是維持破骨細胞功能和促使其分化成熟的重要因子，可促進破骨細胞的分化，增強破骨細胞的活力，而骨保護素（osteoprotegerin，OPG）蛋白能抑制破骨細胞的功能。閔文等[17]研究發現補腎通絡方通過降低RANKL/OPG蛋白表達可抑制破骨細胞功能，抑制骨吸收。過氧化物酶體增殖物活化受體γ協同刺激因子-1α（asubunit of peroxisome proliferatorsactivated receptor-γcoactivator-1，PGC-1α）和類固醇受體輔助激活因子3（steroid receptor coactivator-3，SRC-3）均可通過活化相應的核受體參與雌激素調節的骨代謝過程。研究表明，補腎壯骨顆粒可能通過提高去勢大鼠血清及骨髓組織中SRC-3和PGC-1α分子及基因表達水平，以促進骨形成，提高骨密度[18]。鄭志堅等[19]通過構建體內去卵巢小鼠OP模型和體外骨疏康顆粒含藥血清誘導破骨細胞分化和凋亡模型，明確了骨疏康顆粒防治PMOP是通過誘導體內外破骨細胞凋亡，抑制破骨細胞的骨吸收，從而減少骨量丟失實現的。轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）可通過調節成骨細胞和破骨細胞的分化和功能，實現對骨骼生長發育的調控。鄧洋洋等[20]研究表明補腎活血方可上調大鼠腎組織中ATF4蛋白表達，下調大鼠骨組織中ATF4蛋白表達，以促進成骨細胞增殖分化和抑制破骨細胞增殖分化。股骨骨礦含量（bone mineral content，BMC）是判斷骨質疏松中骨量丟失的重要指標。安方玉等[21]研究表明溫腎強身散可提高大鼠股骨組織中BMC的水平，進而抑制骨組織的吸收，促進骨組織的形成。成骨細胞特異性轉錄因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、成骨細胞特異基因（osteoblast specific gene，Osterix）是成骨細胞分化和成熟的重要特異性轉錄因子，可促進骨形成。王劍等[22]研究發現鹿茸中藥復方可下調去卵巢骨質疏松癥大鼠骨組織Runx2、Osterix啟動子甲基化水平，促進其轉錄和表達，從而促進成骨細胞分化，有效防治PMOP。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）參與了骨基質的鈣化和重吸收。骨唾液蛋白（bone sialoprotein，BSP）與骨代謝關系密切。受體整合素ɑvβ3（receptor integrin ɑvβ3，Itgɑvβ3）可與OPN和BSP相互作用，調控骨吸收功能。研究表明青娥方可使卵巢切除大鼠骨組織OPN、BSP和Itgɑvβ3表達下降，抑制破骨細胞功能活性，減少骨質丟失[23]。

3.4 對骨代謝的調節作用 骨組織是由破骨細胞吸收舊骨和成骨細胞形成新骨以完成骨轉化的活組織。在骨轉化過程中，鈣磷代謝調節指標、激素與細胞因子、骨吸收標志物和骨形成標志物等骨代謝生化指標發揮著重要的調節作用[24]。上述骨代謝指標主要包括堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，BGP）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（aminoterminal propeptide of typeⅠprocollagen，PINP）、Ⅰ型前膠原羧基端前肽（carboxyterminal crosslinked propeptide of typeⅠprocollagen，PICP）和Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽（crosslinked carboxyterminal peptide of typeⅠcollagen，ICTP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP）、β膠原降解產物（β-Crosslaps，β-CTX）等。ALP為特異性的骨形成標志物，可反映成骨細胞的活動。TRACP是骨質疏松癥篩查的敏感指標，同時也是高特異性的骨吸收標志物。PINP、PICP和ICTP是反映膠原代謝的生化指標，其中PINP和PICP反映骨形成，ICTP反映骨吸收。β-CTX是反映骨吸收的特異性敏感指標。BGP由成骨細胞分泌產生，是骨重建的標志物。尿中脫氧吡啶啉（deoxypryidinoline，D-Pyd）是骨和軟骨膠原的特異性指標，是反映骨吸收的重要指標之一。左歸丸可明顯降低去卵巢大鼠尿中D-Pyd含量，提高血清中BGP含量，以促進骨形成和抑制骨吸收，發揮抗骨質疏松癥作用[25]。楊駿杰等[26]研究發現骨疏康顆?？山档挺?CTX的表達，同時提高PINP、BGP、ALP的表達，以延緩骨量丟失。也有研究[27]發現地黃飲子水煎劑可通過提高大鼠血清BGP含量，降低血清TRACP含量，維持骨代謝的動態平衡，發揮抗骨質疏松的作用。劉立萍等[28]研究表明補腎填精方左歸丸可通過降低去卵巢大鼠血清PICP和ICTP含量，干預Ⅰ型膠原的合成與分解，從而防治PMOP。

3.5 對信號通路的調節作用

3.5.1 對Wnt/β-catenin信號通路的影響 經典Wnt（Wingless）/β連環蛋白（β-catenin）信號通路在成骨細胞分化和骨形成過程中扮演著重要角色。Wnt蛋白家族由19個分泌型糖蛋白組成，其中Wnt3a（Wingless 3a）可通過Wnt通路促進成骨細胞的增殖和分化，同時抑制破骨細胞的表達，Wnt7b（Wingless 7b）可顯著增加成骨細胞的數量及活力，抑制破骨細胞的表達[29]。在Wnt信號通路被激活時，β-catenin與核內轉錄因子結合啟動靶基因轉錄，以促進成骨細胞的分化增殖[30]。邢威等[31]研究發現杜仲健骨方可提高大鼠骨組織中Wnt3a和β-catenin的mRNA及蛋白表達水平，表明杜仲健骨方可通過調節Wnt/βcatenin信號通路，發揮治療OP的作用。王慶諺等[32]研究發現補腎益氣活血方可上調Wnt7b、Axis抑制蛋白2（recombinant axis inhibition protein 2，Axin2）、Runx2的mRNA及蛋白表達，即補腎益氣活血方可通過調節Wnt7b/β-catenin信號通路的相關因子，促進成骨分化，從而防治PMOP。

3.5.2 對OPG/RANKL/RANK信號通路的影響 OPG/RANKL/核因子-κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factorκΒ，RANK）信號通路是調節骨吸收和骨形成平衡的重要信號軸，與PMOP有密切聯系。RANK可與RANKL結合使前體細胞內信號開始傳導，以促進破骨細胞（osteoclast，OC）的增殖分化，而OPG可競爭性結合RANKL，抑制OC的活化和骨吸收[33]。姜宜妮等[34]發現二至丸可通過調節PMOP模型大鼠的OPG/RANKL和RANK/RANKL表達水平，抑制OC活性，促進成骨細胞（osteoblast，OB）形成，從而改善骨質疏松。顏春魯等[35]研究發現地黃飲子水煎劑可使PMOP模型大鼠OPG含量升高，而RANKL和RANK含量降低，表明地黃飲子水煎劑可通過調控OPG/RANKL/RANK信號通路抑制骨吸收和促進骨形成，從而發揮抗骨質疏松作用。

3.5.3 對BMP2/Smad/RUNX2信號通路的影響 骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）/細胞信號傳導蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smad）/RUNX2信號通路是參與成骨細胞分化及促進骨形成的重要通路。BMP2可誘導OB分化和促進骨形成，Smad可與RUNX2相互作用參與OB基因的分化及表達[36]。而胎球蛋白A（recombinant human fetuin A，Fetuin-A）和基質gla蛋白（matrix Gla protein，MGP）是BMP2/Smad/RUNX2信號通路中重要的調節因子。相關研究發現PMOP患者血清Fetuin-A水平的降低和MGP在骨組織局部的聚集是疾病發生的重要原因之一[37]。張麟等[38]發現補腎化痰方可通過提高PMOP大鼠血清Fetuin-A含量和降低骨組織局部MGP含量，進而調節BMP2/Smad/RUNX2信號通路實現抗骨質疏松的作用。周亞娜等[39]通過研究發現補腎化痰方也可通過提高血清及骨組織中BMP2和RUNX2含量，影響BMP2/Smad/RUNX2信號通路，起到促進骨形成的作用。

3.5.4 對其他信號通路的影響 除以上通路外，補腎復方還可通過調節其他多種信號通路發揮抗骨質疏松的作用。如金匱腎氣丸可促進成骨細胞內雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）表達，抑制磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated adenylate activated protein kinase，p-AMPK）蛋白表達，促進OB增殖分化，改善OB功能[40]。補腎活血方可通過調節骨內谷氨酸的表達，介導骨重建，改善骨質疏松癥狀[41]。補腎、活血中藥復方（左歸丸、身痛逐瘀湯）可提高indian hedgehog（IHH）mRNA及蛋白表達，以激活IHH信號通路發揮防治骨質疏松作用[42]。補腎化痰方可通過降低血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）及骨組織Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的mRNA和蛋白表達水平，抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路，從而改善骨量丟失[43]。

4 小結

絕經后骨質疏松癥已成為絕經后女性最常見的代謝性骨病，西醫治療本病局限性較多，而補腎復方治療本病療效確切。雖然補腎復方在動物模型中的相關研究對于指導臨床工作具有一定價值，但由于補腎復方中藥物的復雜性，其具體的作用機制及途徑尚不完全明確，且缺少補腎復方中單味中藥對于動物模型的研究，今后應加強復方的具體作用機制及單味中藥的研究，以更好地指導臨床工作。