阿爾茨海默病超微結構研究進展

魏煒 王天雨 孟鑫 張超 李娜 楊志新 任立群

(承德醫學院河北省神經損傷與修復重點實驗室，河北 承德 067000)

阿爾茨海默病(AD)是發生在中樞神經系統的退行性疾病〔1〕。雖然對AD的研究已取得了較大進展，但對其在認知功能和行為能力方面造成進行性損害的病因尚不明確，且無特效治愈藥物，目前的治療僅可進行對癥治療和延緩AD進展。關于AD的發病機制，目前存在多種假說〔2〕，主要為：①膽堿能功能缺陷假說；②淀粉樣假說，β-淀粉樣蛋白(Aβ)的異常沉積；③Tau蛋白過度磷酸化并聚集成神經原纖維纏結(NFT)而引起的Tau蛋白病;④氧化應激和鈣調節失衡等。自1932年電子顯微鏡發明以來，對細胞超微結構的研究進一步深入。AD患者及大鼠的神經元超微結構改變主要為：海馬CA1區神經元萎縮，形態不規則；細胞外Aβ聚集形成中心結構均一，外圍呈星狀的淀粉樣蛋白核心，被營養障礙性突起所包圍；神經元線粒體腫脹、數目減少，分布不均，嵴排列不規則或斷裂變短，基質變淺，線粒體膜模糊、空泡化；內質網應激產生，內質網腔增大、腫脹；含脂滴的次級溶酶體數量增加，脂褐素沉積增多;星形膠質細胞腫大增生呈活化狀態。本文擬從AD的超微結構研究方向進行綜述。

1 Tau蛋白形成與NFT

Tau 蛋白是一種主要的微管相關蛋白，通過與微管蛋白的結合對微管的穩定和軸漿流動的維持起著重要作用，而過度磷酸化的Tau蛋白可以分解微管，導致微管堵塞，進而導致了NFT的形成，阻礙軸漿流動，誘導神經元變性〔3〕。在已知的17號染色體相關的額顳葉癡呆合并帕金森綜合征(FTDP-17)家族中，如外顯子10(P301L,P301S,N279K)、外顯子 9 (G257T,G272V)、外顯子12 (V337M)、外顯子 13 (R406W)〔4〕,其表達與Tau蛋白的過度磷酸化有關。增強了P301S表達的轉基因大鼠，在早期就出現了Tau蛋白過度磷酸化表達，超微結構提示了大鼠軸突纖維喪失和脫髓鞘改變，證實了軸突末端過度磷酸化的Tau蛋白積累與軸突變性、脫髓鞘改變、神經肌肉接處的神經缺失、肌肉萎縮有關〔5〕。關于Tau蛋白的超微結構一直沒有得到證實，實驗中多采用免疫組織化學染色的方法對其過度磷酸化進行檢測，目前研究已經可以通過分辨率3.4～3.5 ?的低溫冷凍電鏡技術得到展示，其結構為神經原纖維病變中成對的螺旋和直絲(PHF和SF)組成的特征結構和相應的原子模型。該細絲核心由兩個相同的原絲組成，包括Tau蛋白的306～378殘基，它們采用了β-交叉/β-螺旋結構的結合，形成了Tau聚集的種子模型。而成對的PHF和SF在原絲間排列方式的不同，表明了其超微結構的多態性〔6〕。

2 Aβ沉積

Aβ是由淀粉樣前體蛋白 (APP) 經一系列α-/β-/θ-分泌酶切割水解產生的，其中產生的Aβ1～40和 Aβ1～42蛋白更具有神經毒性〔7〕，沉積在大腦皮層和海馬區域的細胞外形成老年斑(SP)，能導致神經元的過氧化損傷、Tau 蛋白過度磷酸化、炎癥反應損傷、營養障礙性突起、突觸損傷甚至神經元凋亡〔8〕，最終導致AD的發生?，F在常用的APP/早老素(PS)1轉基因小鼠，其原理為轉入的人APP基因過表達，產生大量的APP，而PS1的共表達促進了Aβ1-42的產生。Aβ的超微結構為細胞外密集堆積的原纖維和細絲〔9〕，聚集形成中心結構均一，外圍呈星狀的淀粉樣蛋白核心，被營養障礙性突起所包圍的典型神經炎性斑塊，周圍可見退變或即將消失的突觸結構和板層解離的髓鞘。Aβ也可沉積于轉基因鼠的海馬微血管旁及微血管壁，其位置可能在基膜層及基膜層外的神經氈結構中〔10〕。在利用斑馬魚自身啟動子appb調控人源APPsw建立的AD轉基因斑馬魚模型中也得到證實，6月齡的APPsw 轉基因斑馬魚血管上出現Aβ沉積導致血管超微結構變化，而神經元的變化出現在9月齡的轉基因斑馬魚上。Aβ對腦微血管的影響早于對神經元的影響，其對AD的作用是相互作用、相互促進的〔11〕。Aβ的產生與其清除之間的不平等是最重要的因素：其清除途徑有：(1)自噬體的產生，在AD小鼠模型腦組織中發現，自噬體的產生早于Aβ在小鼠神經元周圍的聚集〔12〕。體外細胞學實驗證實Aβ無論是由轉基因細胞HEK293產生還是外源性加入，均可誘導自噬體的產生和自噬標志物微管相關蛋白(LC)3過表達，在電鏡下可觀察到具有雙層膜的早期自噬體和囊泡狀的晚期自噬體。Aβ42相比Aβ40伴隨自噬表現出的細胞毒性更強〔13〕。(2)最主要的是通過膠質細胞的膠質蛋白清除，包括：①星形膠質細胞產生低密度脂蛋白受體與Aβ結合使其降解〔14〕；②小膠質細胞吞噬Aβ蛋白，但小膠質細胞激活后產生的炎癥反應也會對神經元細胞造成損傷〔15〕。(3)血腦屏障(BBB)轉運出腦。腦內及外周Aβ由BBB上的晚期糖基化終產物受體(RAGE)將外周的Aβ轉運至大腦，BBB上的低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)-1介導的大腦內Aβ轉運通過BBB進入血液〔16〕。

3 線粒體改變

線粒體為突觸前神經遞質釋放提供所需的能量〔17〕。研究表明，與非突觸線粒體相比，突觸線粒體具有不同的形態和蛋白質組學特征，這可能使突觸特別容易變性〔18〕。由于突觸是高能量需求的場所，因此必須將線粒體運送到該位置。而Tau蛋白在線粒體順行轉運所需微管的結合和穩定中起著至關重要的作用〔19〕。有研究表明，病理性的Tau蛋白可以干擾此轉運過程〔20〕。而線粒體功能障礙和氧化應激已被發現是AD患者和AD動物模型的早期和顯著特征〔21〕。在AD的患者和動物模型中，均可見到線粒體的分裂增加、融合減少，超微結構表現為線粒體腫脹變大變圓且數目減少，分布不均，嵴排列不規則或斷裂變短，基質變淺，線粒體膜模糊、空泡化〔22〕。在分析了人類兩個大腦區域前/后橫顳葉皮質(BA41/42)和背外側前額葉皮質(BA46)的不對稱突觸的超微結構后，觀察到線粒體在突觸前末梢中是突觸后末梢的兩倍至三倍多。超微結構顯示了異常的線粒體形態，突觸中多囊泡體的存在及AD中斑塊附近突觸長度的減少。證實了在AD中突觸線粒體的區域特定變化，并支持了AD中線粒體向突觸前末端的轉運或突觸線粒體動力學改變的觀點〔23〕。在調控融合蛋白線融素(Mfn)2表達消融的大鼠中，電子顯微鏡顯示海馬神經元和許多皮層神經元出現線粒體腫脹和嵴結構異常，線粒體的長寬比均接近1，包含許多小的囊性嵴，其外膜呈彌漫性結構，缺乏雙膜結構及線粒體膜的破裂甚至外膜幾乎不可見。表明成年神經元中的Mfn2消融會引起線粒體破碎和功能障礙，從而通過涉及AD受損的大腦區域中神經炎癥的氧化應激反應導致神經變性〔24〕。

針灸作為國粹，其對AD治療也得到認可。通過針刺AD轉基因大鼠的“百會”“涌泉”“大椎”“腎俞”“太溪”等穴位，可明顯改善AD轉基因大鼠的認知能力，超微結構的觀察中可見到線粒體的結構恢復、功能改善〔25〕。針刺6月齡SAMP8小鼠的“百會”“血?！薄澳I俞”“膈俞”穴，可使其大腦海馬神經元線粒體分裂蛋白(Fis)1的表達減少、線粒體融合蛋白(OPA)1的表達增加，有效提高SAMP8小鼠學習記憶能力，減少線粒體動力學異常，超微結構與模型組相比，線粒體形態基本正常，少數嵴腔擴張、嵴溶解〔26〕。

4 內質網改變

內質網是最大的細胞器，具有網狀的膜結構，由粗面內質網和滑面內質網組成，粗面內質網與核糖體相關，控制蛋白翻譯；滑面內質網包括核膜、細胞質池和小管〔27〕?；鎯荣|網多沿軸突分布，介導細胞微管骨架和線粒體的正常組織結構〔28〕。管狀內質網是滑面內質網的一部分，有證據表明它可能介導囊泡運輸和(或)細胞器接觸，控制細胞通信，調節線粒體融合和分裂〔29〕。網狀蛋白(RTN)是形成管狀內質網所必需的〔30〕。在RTN3免疫反應性營養不良神經軸突(RIDNs)的超微結構中，在軸突末端逐漸積累了管狀內質網，并且管狀內質網異常分布和走向軸突末端出現年齡相關性。在來自AD腦的活檢樣本中的淀粉樣斑塊周圍發現了這種異常的管狀內質網包涵體。在功能上，異常聚集的管狀內質網在營養不良性軸突(DNs)形成的早期階段誘導線粒體裂變增強，并在后期階段最終導致線粒體變性〔31〕。Aβ沉積引起的內質網應激被認為是AD神經元凋亡的重要機制〔32〕。在透射電鏡下 APP/PS1小鼠的大腦皮層神經元內質網腔增大和腫脹，提示APP/PS1小鼠存在內質網應激，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的應用對APP/PS1小鼠皮層異常有明顯的抑制作用，EGCG還顯著降低了APP/PS1小鼠大腦皮層內質網應激標志物GRP78、應激相關的凋亡蛋白CHOP 和Caspase12表達水平〔33〕。

5 突觸萎縮

突觸由3個要素組成：突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜，突觸連接不僅是神經元之間的連接，而且是將動作電位從一個神經元傳遞到另一個神經元的通道〔34〕。突觸前膜中突觸小泡儲存神經遞質，線粒體為神經遞質的釋放提供能量〔35〕。突觸損傷與丟失是AD的一個重要特征。突觸超微結構變化主要為突觸間隙模糊，突觸前后膜界限不清，突觸后膜致密層減少甚至消失〔36〕，海馬區線粒體異常，包括嵴膨大、斷裂合并突觸數量的減少〔37〕。APP/PS1轉基因大鼠的海馬GrayⅠ型突觸活性長度較野生型大鼠明顯縮短，但突觸間隙面積、突觸界面曲率、突觸后致密物厚度無差異〔36〕。該變化也會出現在小腦的浦肯野細胞層。超微結構提示老化的突觸前末梢的突觸小泡和線粒體數量減少，突觸前和突觸后膜的特殊區域變薄〔38〕。小腦顆粒細胞的平行纖維與浦肯野細胞的棘突形成興奮性突觸聯系(PF-PC)，其突觸后致密區(PSD)厚度變薄，突觸間隙變寬，突觸活性帶長度變短及突觸界面曲率變小，最終導致突觸的傳遞效能減弱〔39〕。腦源性神經營養因子(BDNF)調控突觸活動和突觸可塑性〔40〕。突觸素是突觸小泡特異性標記蛋白，與突觸的生長、修復、再生和突觸重塑密切相關〔41〕。其在AD模型小鼠的表達均減少〔39〕。而不論基因型或飲食，均未觀察到大腦皮層神經元突觸數量的差異和線粒體結構、數量的變化〔37〕。

6 膠質細胞作用

6.1小膠質細胞 小膠質細胞是大腦的固有免疫細胞，使用模式識別受體復合物識別并響應sAβ和fAβ〔42〕。下游信號傳導誘導腫瘤壞死因子(TNF)α和白細胞介素(IL)-1β分泌，它們通過趨化作用募集附近的小膠質細胞，并可能引發失控的炎癥反應，損傷神經元并引發突觸損失小膠質細胞對Aβ清除的作用可以防止Aβ沉淀到纖維斑中，并降低引起神經退行性的有害sAβ的腦內濃度〔43〕。小膠質細胞在超微結構上表現為特征性豆狀核，含有密集的異染色質，細胞體中含有大量的線粒體，這些線粒體通常與內質網的典型長片段緊密相連，偶爾伴有高爾基體和吞噬囊泡。APP/PS1小鼠的海馬CA1區的小膠質細胞在與fAβ斑塊相互作用時結構明顯改變，包括突觸結構、吞噬體系統的明顯變化、顯示出內質網應激的增加跡象、脂質包裹體的數量顯著增加。在AD人腦的小膠質細胞超微結構中，也發現小膠質細胞接觸營養不良的神經突和樹突棘，形成了多個接觸，幾乎完全包圍了營養不良性神經突的多個側面，其中含有一個或多個吞噬包涵體〔44〕。

6.2星形膠質細胞 星形膠質細胞的活化通常被認為是AD中的神經炎癥毒性反應。反應性星形膠質細胞可通過吞噬和降解Aβ來限制淀粉樣病變〔45〕。而星形膠質細胞的反應性可以通過中間絲蛋白(GFAP)的表達增加及形態上通過其突起的肥大部分在淀粉樣蛋白斑塊附近被明確識別〔46〕。APP/PS1小鼠海馬中Aβ斑塊周圍的反應性星形膠質細胞廣泛均勻地遍及年輕APP/PS1小鼠海馬所有區域，不管該區域有沒有細胞外淀粉樣蛋白沉積。反應性星形膠質細胞在APP/PS1小鼠海馬的斑塊內和斑塊周圍表現出具有肥大形態的反應性表型和擴展過程，GFAP表達增強，包裹并吞噬了營養不良性軸突和突觸前部分，其星形膠質細胞反應性隨年齡及淀粉樣蛋白病理改變平行發展。同時還在AD患者的海馬中檢測到了這些吞噬性星形膠質細胞〔47〕。APP/PS1 轉基因小鼠海馬區神經元和星形膠質細胞內線粒體固縮，含脂滴的次級溶酶體數量增加;星形膠質細胞腫大增生呈活化狀態，并吞噬營養障礙性突觸〔48〕。

綜上，關于AD的研究已持續百年，隨著研究技術的進步，從疾病表現、診斷、治療的臨床層面到發病機制、模型復制、分子生物學、基因學的研究，醫務工作者、科研工作者對其研究到達了全新的高度。電子顯微鏡技術在分子生物學的協作下對超微結構的研究更加細化，因為倫理的關系，對AD的超微結構研究停留在復制的動物模型和患者死后的尸體解剖上，動物模型畢竟不完全等同于人類，死后的代謝改變對研究也有一定干擾，電子顯微鏡所需組織僅需1 mm3，如能在AD患者的腦組織中進行活檢取材，發現新的突觸變化或內質網-線粒體連接改變及膠質細胞發揮的雙向作用，會有更大研究突破。