外泌體在過敏性疾病中的研究進展

呂婷 劉東璞 盛延良 薛超 彭玲 盧鳳美

(佳木斯大學基礎醫學院微生態-免疫調節網絡與相關疾病重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007)

過敏性疾病因其復雜的發病機制和臨床表現對于臨床醫學的診斷、治療及法醫學鑒定方面都是急需解決的一項難題。外泌體是一種大小為30～150 nm的雙層膜囊泡。其強大的細胞通訊功能可直接影響下游細胞功能及生物學特性，在固有免疫應答中Toll樣受體(TLR)調控、轉錄調節及調控上皮間質轉化外泌體在過敏性疾病中都發揮不可磨滅的作用。過敏性疾病在全球目前呈持續增長的趨勢，自2000年以來，食物過敏、嗜酸性食管炎和藥物性過敏反應的流行率已上升到流行病的比例〔1〕。不同疾病釋放的外泌體含量及特異性遺傳信息也不盡相同〔2〕。在過敏性疾病中，外泌體釋放數量各有差異，外泌體內攜帶的物質信息亦有區別。本文主要論述外泌體的基本特征及其在過敏性疾病的作用。

1 外泌體概述

1.1外泌體發現 1983年，學者在綿羊的網織紅細胞中首次發現外泌體的存在，剛開始人們都認為外泌體是人體的一種沒有任何作用的排泄物，并未過多關注〔3〕。后來發現它是有功能的，主要參與物質之間的信息傳遞交流及信號轉導等，隨后1987年被命名為外泌體。外泌體幾乎被除成熟紅細胞外的所有細胞釋放，在人體血液〔4〕、尿液〔5〕、唾液〔6〕、支氣管肺泡灌洗液(BALF)〔7〕中均可檢測不同含量外泌體。

1.2外泌體釋放機制和功能 外泌體釋放機制主要為兩種：(1)細胞膜外部分子內化形成核內體，晚期核內體通過核內體膜進一步內出芽變為一個小的囊泡(ILV)，隨之形成許多囊腔內多囊體即多泡體( MVBs)。(2)內分體分類復合體(ESCRT)獨立出芽〔8〕，ESCRT由30種蛋白質組成，其中包含4種功能亞復合物，ESCRT-0亞復合物分隔泛素化的蛋白TSG101和 VPS4B，ESCRT-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ直接輔助ILVs出芽，而液泡蛋白分選因子復合物Vps4確保了最終的膜斷裂和(或)ESCRT循環，最后輔助因子凋亡連鎖基因2相互作用蛋白(ALI)X將膜蛋白分成囊泡，囊泡隨后出芽成MVBs〔9〕。整個ESCRT通路過程是ATP酶依賴的，它通過酶作用完成膜脫落〔10〕。MVBs最終與細胞膜融合，此時多泡體內物質被釋放入外部環境中，即外泌體。外泌體主要作用：(1)疾病的診斷，其攜帶豐富的信息及外部雙層膜結構，可有效避免囊泡內物質被破壞。外泌體存在于各體液中，易于獲取。Jin等〔11〕在腺癌(AC)和鱗狀細胞癌(SCC)患者研究中發現，AC患者外泌體內miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p與健康志愿者相比顯著增高(P<0.05)，SCC患者外泌體中miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b特異性強，有助于AC和SCC診斷。(2)參與細胞間通訊，構建新的物質傳輸載體通路，是攜帶藥物適合的載體。外泌體分子結構小，生物相容性高，可攜帶核酸、蛋白質和脂質等。Tian等〔12〕研究表明靜脈注射靶向外泌體能將阿霉素特異性輸入腫瘤組織中，能抑制腫瘤生長且未表現出明顯毒性。(3)疾病的治療靶點，將不同細胞來源的外泌體作為治療靶點治療疾病。Kordelas等〔13〕實驗證明將間充質干細胞(MSCs)來源的外泌體用于移植物抗宿主病治療發現患者對外泌體的重復注射耐受性良好，不僅沒有實質性的副作用，還可減輕患者臨床癥狀。

1.3外泌體的提取及鑒定 目前外泌體的提取主要是使用離心法，首先用低速離心除去液體中的大質量蛋白，然后采取超高速離心法便可分離出大小均勻的外泌體，該方法可以得到較純凈的外泌體。該方法操作較麻煩，提取率相對較低，目前仍是主要使用的方法。試劑盒(Invitrogen、Exo-spinTM)等提取外泌體更高效快捷，未來可能替代離心法成為一種新的趨勢。鑒定外泌體可在投射電鏡下觀察外泌體形態均勻多呈杯狀或盤狀、大小一致，均為30～150 nm，也可以通過外泌體表面特異性采用標記蛋白經蛋白印跡技術，可見CD63、CD9、CD81等高表達。納米粒子追蹤分析亦可對外泌體進行定量分析，且能更好減少外泌體結構被破壞〔5〕。

2 外泌體與過敏性疾病

2.1外泌體與變態反應性鼻炎(AR) 特異性個體接觸過敏原后，引起各種免疫活性細胞與細胞炎性介質共同參與的鼻黏膜慢性非感染性炎癥即過敏性鼻炎，且這一過程是由IgE介導的〔14〕。IgE與肥大細胞表面受體結合導致輔助性T細胞Th1/Th2平衡失調，Th2釋放促炎介質白細胞介素(IL)-5、IL-4等引起過敏反應。Zhu等〔15〕在AR 患者鼻腔黏液和用卵清蛋白(OVA)刺激的鼻腔上皮細胞培養實驗中不僅發現鼻腔黏液中可分離出外泌體，還可見長鏈非編碼RNA生長停滯特異性轉錄本(LncGAS)5高表達。研究結果表明上皮來源外泌體LncGAS5部分通過下調轉錄調節因子T-bet和Zeste Homolog2的增強子(EZH)2來介導Th1/Th2的分化，主要是抑制Th1分化，促進Th2分化，由此可見lncGAS5 是介導 Th1/Th2 細胞分化的不可缺少的介質，這項研究也表明外泌體在AR中的關鍵介質作用。Wang等〔16〕在鼻炎患者鼻黏膜檢測中發現，相對健康測試者AR患者鼻黏液中高表達外泌體lncRNA核旁斑點組裝轉錄本(NEAT)1，而NEAT1表達與鼻炎的嚴重程度相關,這一過程主要是通過調節microRNA-511/核受體亞家族4A組成員(NR4A)2軸而實現的。Wu等〔17〕在IgE水平升高的臍帶血和AR兒童鼻黏液提取到的外泌體中發現miR-21和miR-126水平顯著降低。隨后將miR-21前體轉染到單核細胞中抑制了轉化生長因子(TGF)β受體(TGFBR)2的表達，可見miR-21在調節TGFBR2中發揮作用。而TGFBR2在之前的證據表明可能是抑制IgE產生的代償機制〔18〕。除此之外，Fang等〔19〕實驗證明人間充質基質細胞的小細胞外泌體可通過傳遞miR-146a-5p來減輕第2組先天淋巴樣細胞顯性的過敏性氣道炎癥，包括過敏性鼻炎、支氣管哮喘(BA)等。

2.2外泌體與BA 哮喘是最普遍的慢性呼吸道疾病之一，影響著世界上近3億人〔20〕。在對中國北京2010～2011年14歲以上哮喘患者流行病學調查顯示，哮喘的發病率為1.19%，且有增加趨勢〔21〕。

2型細胞驅動氣道炎癥引起哮喘發生，特異性病理表現主要為氣道內嗜酸性粒細胞和肥大細胞,還有中性粒細胞及各種炎細胞浸潤。目前哮喘的治療目標仍然控制癥狀和炎癥因子以避免病情惡化。Mazzeo等〔22〕研究發現與健康者相比，哮喘患者嗜酸性粒細胞可以釋放的外泌體數量更多,且對哮喘發病及病情嚴重程度可能有作用。嗜酸性粒細胞分泌的外泌體導致氣道黏液分泌增多，小氣道的痙攣還能反作用于嗜酸性粒細胞釋放更多外泌體，而氣道高反應性的增加也是其分泌的外泌體通過活化及增強促炎因子的聚集和釋放達到的。Du等〔23〕研究證實間充質干細胞源外泌體可以上調哮喘患者外周血單核細胞M2 樣表型中的TGF-β1和 IL-10 來刺激調節性T細胞(Tregs)增殖和分泌從而發揮抗炎作用，而這一反應可能是通過抗原遞呈細胞的內化而實現的。外泌體可以攜帶體內各遺傳物質隨著體液及胞吞胞吐作用轉運至相應靶細胞發揮作用，從而有助于哮喘的治療。其中哮喘患者BALF中miRNA-449已經被發現可以調節氣道纖毛細胞的分化，促進中心粒增殖和多纖毛發生，部分是通過靶向NOTCH1mRNA發揮作用的〔24〕。研究發現哮喘患者的BALF外泌體中存在大量的白三烯(LTs)C4合酶(LTC4S)，而超敏反應釋放的炎癥因子LTs途徑被證明存在于外泌體，是LTs生物合成酶的載體，改變毛細血管和微靜脈血管通透性，引起哮喘發生外泌體的半胱氨酸(cys)LT代謝能力同時也增強了外泌體特異性釋放的具有更強大信使功能的納米囊泡〔25〕。在重型哮喘的研究中，Haj-Salem等〔26〕發現嚴重哮喘患者的成纖維細胞中釋放的外泌體中TGF-β2增強，導致上皮細胞增殖減少，而下調TGF-β2則增強上皮細胞增殖，在嚴重哮喘患者外泌體檢測中證實TGF-β2明顯低于健康者，此項實驗亦證明外泌體中至少部分促進氣道重塑。嚴重的類固醇抗性哮喘(SSRA)患者由于抵抗類固醇激素導致治療效果極差，生活質量嚴重惡化。Dong等〔27〕發現間充質干細胞來源外泌體(MSC-Exo)處理對巨噬細胞極化、核因子(NF)-κB和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路的影響依賴于腫瘤壞死因子相關因子(TRAF)1，通過抑制TRAF1來重塑巨噬細胞的極化，調整炎癥從而可改善SSRA。

2.3外泌體與過敏性接觸性皮炎(ACD) ACD是一種由接觸皮膚的各種物質的免疫反應引起的皮疹〔28〕。其發病率尚未明確定義，但其發病率一直被認為是持續增加的，常見的相關過敏原包括羊毛脂、甲醛、倍半萜內酯混合物及ACD患者個人護理用品中各種成分。ACD臨床表現多樣而復雜，癥狀輕微的ACD常使人心情煩躁，嚴重時還會影響患者日常生活，甚至工作能力，由此引起的一些民事醫療索賠案件也占有一定比例〔29〕。此外，ACD很少單獨存在，常伴隨AR、過敏性哮喘等其他過敏性反應同時存在。角質形成細胞是皮膚最外層保護屏障,角質形成細胞排列紊亂，角質層呈網籃狀是ACD常見病理變化,有學者在ACD患者血液中提取超出正常人群數量的外泌體,通過電鏡觀察出外泌體的大小,用二代基因測序發現最具差異表達的miRNA-150-5p，然后將不同濃度的外泌體與角質形成細胞共同培養發現不同濃度的培養皿中可檢測到炎癥介質IL-33、趨化因子CXCL1、CXCL2不同程度上調，而間充質來源外泌體可通過抑制促炎因子表達，增強抗炎因子表達從而發現治療ACD可行靶點〔30〕。此外，外泌體中miRNA-150-5p還可在ACD中參與各種通路的表達,靶向作用于人高遷移率族ATHook蛋白(HMG)2基因，促進角質形成細胞增殖、細胞活化及炎癥發生〔31〕。

2.4外泌體與過敏性休克(AS) AS是一種嚴重的、快速發展的、可能致命的全身反應。接觸過敏原后，觸發機體發生反應，引起肥大細胞脫顆粒釋放出許多影響血管通透性、血管平滑肌張力和支氣管的炎性介質及細胞因子(LTs、C3a、C5a)等，激活全身炎癥級聯放大反應，從病理生理學角度來看，這一機制主要是IgE與受體(FcεRI)結合介導的。另一機制主要由巨噬細胞、嗜堿粒細胞和中性粒細胞等與FcγRⅢ結合誘導特異性過敏反應，即非IgE依賴的過敏反應〔32〕。不論是經過哪一途徑，作為過敏性疾病最嚴重的疾病發展，其中損害最嚴重的就是循環呼吸系統，引起血管擴張，痙攣、器官組織處于充血狀態導致大量體液流失出現休克癥狀。如果沒有及時發現救治患者很快死亡，由此可引起一系列醫療糾紛和死亡鑒定困難等問題。而外泌體作為信息通路的傳播載體，在AS發病機制、診斷及治療中起十分重要的作用。TLR作為機體保護性的免疫哨兵，能夠感應與病原體相關的分子模式，識別損傷細胞分子及內源性配體，介導炎癥的發生。一方面外泌體可通過TLR2調控固有免疫，擴大TLR2對病原體的識別范圍，促進免疫識別,這是通過TRL2/TRL4/MyD88通路實現的〔33〕。另一方面外泌體可調控TLR4,在固有免疫中作為運輸的載體運輸疾病診斷的標志物miRNA。Fang等〔34〕在對弓形蟲感染的小鼠實驗研究中發現，熱休克蛋白70可引起感染小鼠發生致命性過敏反應，而該反應主要依賴TLR4/MyD88通路，熱休克蛋白70作為外泌體表面特異性標志物之一，也提示著外泌體在致命性過敏反應中扮演的重要角色。

綜上，外泌體目前作為疾病診斷和治療的研究熱點，不僅在過敏性疾病中受到廣泛關注，在腫瘤、消化系統疾病、呼吸系統疾病及循環系統疾病中也有不可或缺的作用。生理狀態下外泌體承接運輸載體的作用，激活信號傳輸至相應靶點發揮生物效應。病理狀態下被大量釋放，擴大物質信號傳遞，促進炎癥發生。同時在過敏性疾病中炎癥因子及信號通路中通過各種運輸傳遞方式介導各種過敏性疾病的發生發展。鑒于過敏性疾病的復雜性，外泌體的功能及作用還需進一步研究。過敏性疾病治療主要是對癥治療，外泌體獨特的藥物運輸載體優勢不僅可考慮引入過敏性疾病的長期預防或急救治療，還可考慮運用到臨床診斷中，使得臨床醫生在診斷和治療過敏性疾病更快捷方便。在法醫學領域中由于過敏性猝死案例中常無法得知死者的過敏史、疾病史及生前的治療史等等使得法醫學鑒定者進行死因鑒定困難，外泌體因其良好的雙層囊泡可保護外泌體內核酸、脂質及蛋白質，可有效應對尸體自溶和外界環境因素帶來的干擾，目前外泌體在過敏性猝死研究尚未開展，未來法醫學家可針對過敏性猝死外泌體作為新的研究思路進行探究。