基于頂空固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質譜聯用技術的余甘子揮發性成分分析及抗倉儲害蟲作用研究

黃浩洲 張定堃 李夢琪 譚 鵬 包曉明 莫太剛 樊三虎 韓 麗 林俊芝

(1 成都中醫藥大學藥學院/創新產業研究院,西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都,611137; 2 四川護理職業學院藥學系,成都,610100; 3 四川省中醫藥科學院國家中醫藥管理局中藥質量生物評價重點研究室,成都,610041; 4 島津企業管理(中國)有限公司,成都,610023; 5 成都市三勒漿藥業集團,成都,610000; 6 成都中醫藥大學附屬醫院代謝性疾病中醫藥調控四川省重點實驗室,成都,610072)

余甘子PhyllanthusemblicaL.是大戟科葉下珠屬熱帶、亞熱帶落葉小喬木的果實[1],俗名滇橄欖、油甘子、山油甘、庵摩勒等,是我國西南地區重要的藥食同源中藥資源與經濟作物[2]。余甘子功能潤肺化痰,生津止渴,在利咽、降糖、調節血脂代謝、預防牙齦炎等方面治療和保健作用突出[3]。因此,余甘子在我國藏族、蒙古族、維吾爾族、彝族等16個少數民族中廣泛應用,并在全球17個國家的傳統藥物體系中廣泛使用[4],是聯合國衛生組織指定全球推廣種植的3種保健植物之一。

余甘子氣味清香,回味甘甜。其表皮含有一定精油[5],芳香避穢,賦予其獨特風味。故余甘子被廣泛應用于食品、化妝品和飲料等行業。研究顯示,余甘子精油具有較強的抗菌及抗氧化作用[6-7],是上述功能的主要物質載體之一[8]。課題組調查發現,與其他藥材形成鮮明比較,余甘子在長期貯藏過程中無任何病蟲害現象,推測可能與余甘子獨特的氣味和揮發性成分有關[8]。通過文獻分析發現,在中國和印度,民間常用余甘子退熱、驅蟲、止瀉或殺菌抑菌作用[9],具有一定芳香避穢作用。但目前,關于其抗蟲效果及物質基礎相關研究未見報道,本文遂對其展開研究。

本研究采用超臨界CO2萃取技術對余甘子藥材揮發性成分進行萃取富集得到精油,并基于頂空-固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質譜聯用技術(Headspace Solid Phase Microextraction Gas Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry，HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS),對余甘子藥材及精油成分進行分析。該技術通過建立150多種常見氣味成分的多反應監測(Multiple Reaction Monitoring,MRM)定性離子對、母離子質荷比(m/z)、保留時間(Retention Time,RT)及內置標準曲線等關鍵定性定量數據庫,可快速準確地定性定量余甘子的關鍵氣味成分[10]。此外,本文通過氣味強度分析建立了氣味強度特征譜,可快速分析余甘子揮發性成分氣味物質及抗蟲作用物質基礎。最后,本文以進食率、死亡率和趨避距離為評價指標,對余甘子藥材及精油抗倉儲害蟲的效果進行了評價。通過上述實驗,以期為余甘子揮發油物質基礎、提取及應用等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分析樣品 余甘子藥材,購于中庸飲片有限公司(四川成都),批號：200601Z。

1.1.2 供試昆蟲 供試昆蟲為北京清析研究院實驗室人工飼養的昆蟲。在溫度為(26±1)℃,相對濕度55%～75%的養蟲室中,用全麥粉∶干酵母粉=20∶1(質量比)混合而成的飼料飼養藥材甲、咖啡豆象、米象、印度谷蛾供實驗使用。

1.1.3 試劑 苯乙酮，萘，2,6-二氯苯酚和2,4,6-三氯苯甲醚對照品(Sigma公司，美國，批號分別為：48292，40053，40302，47526-U，質量濃度分別為2，5，2，2 μg/mL，)；4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4的混合對照品溶液、苊-d10對照品溶液(o2si公司，美國，批號分別為310239，314514，304594，質量濃度均為100 μg/L)。

1.1.4 儀器 超臨界CO2萃取裝置(海安華達石油儀器有限公司，型號:SFE230-50-06);三重四極桿氣質聯用儀(島津公司，日本，型號：TQ8050)PAL加熱磁力攪拌模塊和PAL SPME Arrow固相微萃取進樣器(思特斯分析儀器有限公司，瑞士，序列號:ARR15-DVB/C-WR-120/20CT,CTC);電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，型號：XPE26)。

1.2 方法

1.2.1 CO2超臨界萃取方法 采用一次加料,一級萃取,一級分離的方法萃取余甘子精油。取余甘子藥材粉末(過三號篩),500 g一次性加入萃取罐(1 L),對CO2貯罐進行冷卻,設置萃取釜1和萃取釜2的溫度為55 ℃和50 ℃,設置分離釜1和分離釜2溫度55 ℃和50 ℃,當溫度分別達到55 ℃和50 ℃,萃取釜壓力27 MPa,當解析罐的壓力達到6 MPa時關閉CO2鋼瓶,開始循環萃取,調節CO2流量至2.5 mL/min/,恒溫恒壓萃取3 h,從解析罐中得到余甘子精油[6]。

1.2.2 HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS氣相色譜條件 采用InertCap Pure-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱;進樣口溫度250 ℃,分流進樣,分流比為5∶1,進樣口壓力為83.5 kPa;高純氦氣作為載氣,控制方式為恒壓模式;吹掃流量3.0 mL/min;升溫程序為:初始溫度50 ℃維持5 min,并以10 ℃/min程序升溫至250 ℃保持10 min;柱平衡時間為2 min。

1.2.3 質譜條件 離子源為電子轟擊源,離子化能量70 eV,離子源溫度200 ℃,質譜傳輸接口溫度為250 ℃,碰撞氣體為氬氣;質譜監測模式為MRM模式,檢測器電壓相對于調諧結果+0.3 kV,溶劑延遲時間為1.3 min。不同化合物的監測離子對、碰撞電壓見表1。為提高檢測靈敏度,本實驗采用時間分段監測各化合物。

表1 150個化合物定性定量參數和基本信息

1.2.4 頂空-固相微萃取條件 精密吸取余甘子精油(0.1 mL),用研缽與0.5 g淀粉共研磨,使之充分吸附于淀粉上進行稀釋,避免過飽和而影響分析準確性。同時,精密稱取余甘子藥材粉末(過三號篩)0.5 g,將上述精油粉末和藥材粉末分別置于惰性頂空瓶內(20 mL),壓蓋密封,50 ℃平衡40 min。進樣前后,固相萃取頭被置于270 ℃老化裝置中進行老化(3 min),然后插入頂空瓶內,在50 ℃恒溫下萃取吸附樣品揮發性成分10 min,抽出萃取頭并迅速插入已進入預運行狀態下的氣相色譜-質譜進樣口,于250 ℃狀態下解吸附(2 min)后進入質譜進行分析。

1.2.5 供試品定性定量檢測方法 精密吸取1 μL 4種化合物混標進樣分析,評估其系統適用性(取10 mL容量瓶中加入各10 μL的4種標準品溶液,定容搖勻,0.22 μm微孔濾膜過濾即可)。再精密吸取1 μL 3種內標物(0.1 μg/mL)的混標分析,獲得內標物峰面積。最后按照上述條件檢測樣品。所采集數據由島津TQ8050軟件150種化合物的定性離子對數據庫進行定性比對,比對后再根據標準曲線結合內標物質的實測峰面積進行定量。

1.2.6 抗蟲實驗設計 準備3個30 cm×30 cm×30 cm的透明玻璃方格,分別標記為A格B格C格,格內分別放入1 g余甘子藥材和蟲體各3只,觀察其死亡率,進食率和趨避距離。在A格內滴入乙醇1 mL,在B格內滴入余甘子揮發油1 mL,C格內放入余甘子藥材,每天觀察,趨避距離及進食率在3 h、5 h、7 h進行上述觀察。

1.2.7 氣味閾值計算 氣味閾值是指引起人類氣味刺激最小的物質的濃度(pg/mg)。從閾值的定義可以看出,閾值越低,含量越高,則氣味越強。濃度與閾值的比值稱為氣味活度值(Odor Activity Value，OAV):

式中:C代表組分的含量(pg);M代表樣品質量(mg);Th代表組分的氣味閾值(pg/mg)。一般而言,OAV大于0.1的成分應視為對其氣味有貢獻的成分。

2.7 數據處理 使用Hiplot(https://hiplot.com.cn)箱圖工具進行分析。采用SPSS 22.0工具美國(伊利諾伊州芝加哥市SPSS公司)和Oringin 2018(美國馬薩諸塞州漢普頓市OriginLab)進行統計分析。

2 結果

2.1 余甘子藥材及精油揮發性成分鑒定結果 根據數據庫的定性定量分析,余甘子精油和藥材的MRM總離子流圖見圖1,揮發性成分的檢測結果見表2和表3。從圖1中可發現,CO2超臨界提取富集的成分更多,含量更高。從表2和表3中可知,余甘子藥材和精油中分別篩查出70種和58種揮發性化學成分。此外,研究發現,余甘子揮發性成分中多種成分具有特殊香味,如(E)-2-庚烯醛、癸醛、α-松油醇、5-甲基呋喃醛等含量較高的藥材和精油共有成分,它們具有一定的芳香味,可能是余甘子風味的物質基礎。進一步對揮發性成分進行了定量分析發現,藥材和精油中均以乙酸的含量最高,這是其酸味氣味的物質基礎(圖2A,B中最高的峰為乙酸)。但精油中含量略低,可能與超臨界提取的物質的極性有關。

表2 余甘子精油化學成分鑒定結果

表3 余甘子藥材化學成分鑒定結果

從表2和表3數據中可以發現,精油與藥材成分大致相似。其中含量較高的成分以乙酸、乙酸乙酯、正辛醛、(E)-2-庚烯、α-松油醇、5-甲基呋喃醛、己酸、丁酸和丙酸等為主。不難發現,余甘子富含酸類成分,該類成分對昆蟲無殺蟲作用,但其刺激性氣味具有一定的趨避作用。此外,該類物質對于微生物具有較強的抑制作用。

2.2 余甘子氣味成分譜與氣味強度特征譜 為了更清晰直觀地反映余甘子藥材和精油中的化學成分含量及氣味貢獻程度,本文基于其濃度和(OAV,構建了余甘子氣味成分譜(Odor Component Spectrum,OCS)和氣味強度特征譜(Odor Intensity Characteristic Spectrum,OICS)。在圖2中,以150種氣味化合物編號為橫坐標(化合物名稱以表1編號代替),以氣味強度為縱坐標,得到余甘子氣味強度特征譜。根據2.6中氣味閾值的計算得到氣味強度,一般認為氣味強度大于0.1的成分,表示它能被人體識別并產生氣味貢獻。通過樣品的氣味特征譜,可快速地發現對氣味變化有關鍵貢獻的化合物,并較為直觀、方便地表征其整體氣味輪廓差異,分析關鍵活性成分。

從OCS整體來看,CO2超臨界提取富集得到的成分更多,含量更高,主要以萜烯類極性較小的成分為主(76號化合物),而極性較大的成分如乙酸等的富集較藥材更少。從圖2A和B都可直觀展發現,余甘子藥材和精油中均含有大量的乙酸。然而在氣味特征譜中,由于乙酸等成分的閾值較高,所以對氣味的貢獻并不十分明顯。而一些含量較低的成分反而具有較大的氣味貢獻,如50和78號成分等。這些微量成分可能是構成余甘子特殊風味的關鍵。氣味閾值是氣味成分和氣味受體蛋白結合的綜合體現。因此,構建氣味強度特征譜,進一步明確昆蟲氣味閾值,對于抗蟲氣味成分的篩選具有一定意義。

2.3 余甘子藥材及精油抗蟲作用測定結果 采用死亡率、進食率和趨避作用對余甘子抗蟲作用進行研究,結果如圖3和圖4所示。死亡率結果顯示:空白組中藥材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾在實驗開始后,未出現死亡現象,死亡出現在最后2 d,死亡率為17%。余甘子精油組中,第3天開始死亡率開始上升到33%左右,第4天后死亡率增加到66%,并趨于穩定,第7天全部死亡。余甘子藥材組中隨著進食天數的增加,死亡率從第3天開始逐漸增加到17%,第4天25%,第5天58%,第6天75%,最終實驗結束后全部死亡。進食率結果顯示:空白組中藥材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾的進食率在最開始出現一定的昆蟲不進食的現象,以前2個昆蟲為主,其余昆蟲影響不大。余甘子精油組中,不同昆蟲進食率有一定下降,但都在94%以上。余甘子藥材組中,進食率呈進一步下降的趨勢,但總體在96%以后3個。對以上結果顯示,余甘子精油和藥材對倉儲害蟲具有一定的毒性作用,但對進食率影響不大。

趨避距離結果顯示:空白組中昆蟲在加入乙醇后,均往玻璃格邊緣靠近。隨著實驗開始,昆蟲活動區域開始逐漸變大,噴灑區域也開始出現活動跡象,慢慢聚集在進食區域,昆蟲趨避距離從10～15 cm降低為5～8 cm。余甘子精油組中,藥材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾開始明顯遠離進食區域,分散在邊緣處,且初始趨避距離較大,在10～15 cm以上。其中米象的趨避距離甚至隨時間推移增加,達到18 cm左右。其他昆蟲趨避距離有一定下降趨勢,但整體明顯高于空白組。余甘子藥材組中4種昆蟲在開始明顯遠離進食區域,主要分布在邊緣處以及進食區與邊緣處中間位置,趨避距離達到9～13 cm。隨著時間推移,趨避距離雖有一定下降,但是下降趨勢較精油組更弱。以上結果顯示,余甘子藥材和精油短期內驅蟲效果明顯,以精油最佳。

3 討論

近年來,利用植物源性殺蟲劑控制倉儲害蟲的研究已引起了廣泛關注。其具有良好的生物活性,是綠色驅蟲劑的替代品之一,具有抗菌、消炎、抗氧化、驅蚊和驅蟲的作用,對環境友好、對人畜安全,易于分解,并有使節肢動物產生耐藥性降低的可能[11]。

研究發現,高含量的酸類成分可能是余甘子久置不腐的原因之一[12]。乙酸乙酯對昆蟲有一定的麻醉作用,在昆蟲學實驗中,乙酸乙酯是一種常用的窒息劑,常用于昆蟲的采集[13],具有一定的驅蟲作用。此外,α-松油醇廣泛存在于植物精油中,對玉米象、小菜蛾等害蟲具有良好的趨避和殺蟲活性,致死中濃度為3.22 mg/L左右,是一種不可多得的天然產物[14]。而一種抗蟲的重要物質芳樟醇在藥材中大量存在,但是在精油中含量更少[15]。推測可能和其自身理化性質有關,需要進一步優化提取工藝。此外,余甘子精油和藥材中還含有一定的薄荷腦、香葉醇、苯酚、萘等成分,是一類具有一定抗蟲驅蟲及抗菌作用的物質[11],但含量相對較低,可能起到輔助作用。綜合來看,其抗蟲作用更是“多組分、多效應、多層次”的綜合結果,上述成分可能是余甘子“芳香避穢”的物質基礎[16-17]。

此外,由于提取極性的原因,超臨界提取大部分是極性較弱的成分,而部分抗蟲成分如乙酸乙酯、芳樟醇及一些抗微生物的成分如乙酸、丙酸、丁酸等含量較少,但α-松油醇等萜烯類及單萜類含量較高。這導致藥材和精油的抗蟲作用各有自身特點。藥材中小分子酸類成分等抗蟲抑菌成分含量較高,而精油中脂溶性萜類成分明顯含量更高。抗蟲成分主要以萜烯類成分為主,總體而言精油的抗蟲效果更佳。綜合抗蟲作用研究表明,余甘子的抗蟲作用較強,但表現為驅蟲作用而非殺蟲作用。但其抗蟲作用可能并非單一成分的作用,而是“多組分、多效應、多層次”的協同作用結果[18]。后期可進一步通過氣味結合蛋白、氣味受體的觸角生物電位作用篩選抗蟲關鍵成分[19-20],探明抗蟲機制,進一步優化其提取制備工藝。本文首次提出余甘子抗倉儲害蟲作用,對其物質基礎進行研究,并初步評價了其抗蟲活性,以期為余甘子抗蟲作用挖掘和應用開發提供參考。