三勒漿安全性評價及功能作用研究

莫太剛 樊三虎 鄭有德 陳小紅 孟倫秀 駱學慶 張立實 黃 輝 張定堃

(1 成都三勒漿藥業(yè)集團四川華美制藥有限公司,成都,610045; 2 乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室,成都,610023; 3 成都三勒漿藥業(yè)集團-成都中醫(yī)藥大學產學研聯合實驗室,成都,610045; 4 新控國際健康管理有限公司,成都,610045；5 四川大學華西公共衛(wèi)生學院,成都,610044; 6 成都中醫(yī)藥大學藥學院,成都,611137)

三勒漿源于李肇《唐國史補》“三勒漿……法出波斯，三勒者謂庵摩勒、訶梨勒、毗梨勒”，唐代時從絲綢之路傳入我國,成為當時的宮廷飲品并延續(xù)至今，由使君子科植物訶梨勒(訶子TerminaliachebulaRetz.)和毗梨勒[毛訶子Terminaliabellirica(Gaertn.)Roxb.],與大戟科植物庵摩勒(余甘子PhyllanthusemblicaL.)3種植物果實制作而成[1-2]。“三勒”也稱“三果”，3種藥材被奉為藏藥之王，藏藥經典《晶珠本草》和《中國藏藥》《中華人民共和國藥典》中均有收錄[3]。在印度阿育吠陀傳統(tǒng)醫(yī)藥文化中,三果(Triphala)是最著名的常用藥物之一,也是日常食用的果品和咀嚼料[4]。三勒漿牌三勒漿飲品(以下簡稱“三勒漿”)是在此基礎上輔以L-精氨酸、L-天門冬氨酸、蜂蜜等組成的保健食品,其中所含的多酚類成分可清除人體內的自由基,從而減輕自由基對人體的損傷,使其具有良好的調節(jié)免疫及抗疲勞等活性[5-8]。

本研究依據《食品安全性毒理學評價程序和方法》及《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》[9-10],開展口服急性毒性、30 d喂養(yǎng)實驗、埃姆斯(Ames)實驗、小鼠微核實驗、小鼠精子畸形實驗研究[11]，以及抗疲勞、免疫調節(jié)和耐缺氧的功能作用[12-14],為三勒漿作為保健食品的安全性與功效學提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

1.1.1.1 經口急性毒性動物 2周齡,昆明種小鼠(合格證號：川實動管質第85號)，體質量(20±2)g，40只，雌雄各半;6周齡，SD大鼠(合格證號:川實動管質第92號)，體質量(200±20)g，40只，雌雄各半，均由四川省抗菌素工業(yè)研究所提供。

1.1.1.2 30 d喂養(yǎng)實驗動物 6周齡，SD大鼠(合格證號：川實動管質第92號)，體質量90～130 g，80只，雌雄各半，由四川省抗菌素工業(yè)研究所提供。

1.1.1.3 小鼠骨髓細胞微核實驗動物 4周齡，雄性昆明種小鼠(合格證號：川實動管質第85號)，體質量25～30 g，50只。

1.1.1.4 小鼠精子畸形實驗動物 4周齡，雄性昆明種小鼠(合格證號：川實動管質第85號)，體質量25～30 g，雌雄各半，25只。

1.1.1.5 抗疲勞功能評價實驗動物 2周齡，成年雄性昆明小鼠(合格證號：川實動管質第98-6號)，200只，由原衛(wèi)生部生物制品研究所提供。

1.1.1.6 免疫調節(jié)功能實驗動物 2周齡，雌性BALB/C小鼠(合格證號：川實動管質第64號)，體質量(20±2)g，250只，雌雄各半，由華西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.1.7 耐缺氧功能評價實驗動物 2周齡，昆明種小鼠(合格證號：川實動管質第67號)，體質量(20±2)g，160只，由四川省抗菌素工業(yè)研究所提供。

1.1.1.8 飼養(yǎng)環(huán)境及條件 以上清潔級動物均常規(guī)飼養(yǎng)于潔凈動物房(合格證號：川實動管81號)，并提供動物全價基礎營養(yǎng)飼料，動物自由攝食和飲水。

1.1.2 樣品 三勒漿樣品由四川華美制藥有限公司提供(批號:9904009)。

1.1.3 試劑與儀器 絲裂霉素C(MMC，中國食品藥品檢定研究院，批號:19980706)、2-胺基芴(2-AF,上海皓鴻生物醫(yī)藥技術有限公司，批號:19980523)，TA97、TA98、TA100、TA102：(美國分子毒理有限公司，批號：19981103)、環(huán)磷酰胺(CP,上海卓因生物醫(yī)學技術有限公司，批號:19981101)、2,4,7-三硝基-9-芴酮(TNFone,上海皓鴻生物醫(yī)藥技術有限公司，批號分別為19971208、19980318)、疊氮化鈉(科密歐化學試劑有限公司，批號分別為19980325)、動物肝細胞S-9混合液(無錫欣潤生物科技有限公司，批號:19981106)、乙醚(成都科隆化學試劑廠，批號:19980612)、鈉石灰,凡士林,亞硝酸鈉(成都科隆化學試劑廠，批號分別為19980919、19980821、1998052)、綿羊紅細胞(Sheep Red Blood Cel,SRBC)采自健康綿羊頸靜脈、雞培養(yǎng)紅細胞(Cultured Red Blood Cell,cRBC)采自健康公雞心臟血。希森美康血液分析儀(上海愷梵實業(yè)有限公司,型號:XT-2000i)；電子秤(上海大和衡器常廠,型號:ACS-3)；切片機(賽默飛公司，美國，型號:HM325)、自動組織包埋機(江蘇常州中威電子儀器廠，型號：BMJ-Ⅲ)、病理組織漂烘儀[普瑞斯星(常州)醫(yī)療器械有限公司,型號：PHY-Ⅲ型]；Nikon顯微鏡(上海衡浩儀器有限公司,型號:eclipse80i)；酶標分析儀(上海第三分析儀器廠,型號:511)。

1.2 方法

1.2.1 安全性實驗方法

1.2.1.1 急性毒性實驗方法 霍恩法(Horn)小鼠和SD大鼠均按4.64、10.0、21.5 mL/kg系列劑量,給藥1次，灌胃后連續(xù)觀察2周。

1.2.1.2 30 d喂養(yǎng)實驗方法 斷乳SD大鼠,依據體質量按照隨機數字表法隨機分為4組(下同),每組20只,雌雄各半。低劑量組、中劑量組、高劑量組每日分別按2.5、5.0、10 mL/kg灌胃給三勒漿,共30 d。另設一空白對照組(劑量為0)。測定實驗期內動物的每周飼料給料量和剩余量、體質量，計算攝食量、平均增重和食物利用率。實驗結束后,進行血液學、血清生化及組織病理學的檢查和臟器系數(器官對體質量的相對重量)測定。

1.2.1.3 Ames實驗方法 按《食品安全性毒理學評價程序和方法》以TA97、TA98、TA100和TA102實驗菌株進行加與不加大鼠肝S9的標準平板滲入法。實驗樣品設5個劑量:12.5、25.0、50、100、200 μL/皿。每次實驗同時設陰性(蒸餾水100 μL/皿)和陽性對照。不加S9的陽性對照:TA97和TA98用TNFone,TA100用NaN3,TA102用MMC;加S9實驗的陽性對照均用2-AF。每個實驗劑量作3個平行皿,重復實驗2次。

1.2.1.4 小鼠微核實驗方法 昆明種小鼠按體質量隨機分為5組,每組10只,雌雄各半。三勒漿2.5 mL/kg組、5.0 mL/kg組和10.0 mL/kg組;陰性對照組蒸餾水灌胃;陽性對照組,給環(huán)磷酰胺40 mg/kg。分別于第0小時和第24小時2次經口給藥,第30小時處死小鼠,取胸骨骨髓制片,固定后染色，鏡下觀察1 000個嗜多染紅細胞，記錄帶微核的細胞數。

1.2.1.5 小鼠精子畸形實驗方法 雄性昆明種小鼠每組5只,共5組。3組三勒漿劑量:2.5、5.0和10.0 mL/kg;陰性對照組,蒸餾水灌胃;陽性對照組,給環(huán)磷酰胺40 mg/kg。灌胃給三勒漿5 d,于首次灌胃后第35天處死動物,取雙側附睪作精子涂片，固定后染色,鏡下觀察精子形態(tài)。每支動物觀察1 000精子,記錄形態(tài)異常的精子數。

1.2.2 抗疲勞功能實驗方法 成年雄性昆明種小鼠,按體質量隨機分為4組,即蒸餾水對照組和三勒漿2.5 mL/kg組、三勒漿5.0 mL/kg組、三勒漿10.0 mL/kg組(分別相當于推薦人體飲用量的5、10、20倍)。各組均按2%體積每天灌胃,連續(xù)30 d。于末次灌胃30 min后,分別進行負重游泳實驗(小鼠尾部負重5%鐵絲)、血清尿素氮、肝糖原、血乳酸含量測定。

1.2.3 免疫調節(jié)功能實驗方法

1.2.3.1 動物分組與給藥 雌性小鼠,基礎飼料喂飼3 d后,按體質量隨機分為三勒漿5.0 mL/kg組、三勒漿10.0 mL/kg組和三勒漿15.0 mL/kg組(分別相當于廠方推薦的成人日食用量的10、20和30倍及對照組,實驗動物以相應劑量的三勒漿灌胃,對照組以蒸餾水灌胃,1次/d,連續(xù)灌胃25 d。

1.2.3.2 遲發(fā)性變態(tài)反應(足趾增厚法) 連續(xù)灌胃20 d后,用2%(v/v)SRBC腹腔免疫,每只0.2 mL,免疫4 d后,測量左后足趾部厚度,測定3次取平均值;然后在測量部位皮下注射20%(v/v)SRBC,每只20 μL注射后于24 h測量左后足趾部厚度,測定3次取平均值。計算攻擊前后足趾厚度的差值,以差值表示小鼠的遲發(fā)性變態(tài)反應的程度,并進行統(tǒng)計學處理。

1.2.3.3 血清溶血素測定(血凝法) 連續(xù)灌胃20 d,每只小鼠腹腔注射2% SRBC 0.2 mL免疫,繼續(xù)灌胃4 d后,摘除眼球取血于離心管內,放置1 h,剝離,2 000 r/min,離心半徑16 cm，離心10 min,收集血清,用生理鹽水將血清進行倍比稀釋,每份稀釋14孔,將不同稀釋度的血清置于血凝板中,每孔100 μL,再加入0.5% SRBC懸液100 μL,混勻,置濕盒37 ℃ 3 h,觀察結果,記錄每孔的凝集程度,按公式計算抗體積數(抗體積數=S1+2S2+3S3+……nSn),并進行統(tǒng)計學處理。

1.2.3.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內法) 連續(xù)灌胃25 d后,于每鼠腹腔注射20%雞紅細胞懸液1 mL,30 min后,頸椎脫臼處死,將其固定在鼠板上,正中剪開腹壁皮膚,經腹腔注入生理鹽水2 mL,轉動鼠板1 min,吸出腹腔洗液1 mL,平均滴于2張載玻片上,置濕盒37 ℃ 30 min,取出在生理鹽水中漂洗,晾干,固定,4%吉姆薩染色3 min,蒸餾水漂洗晾干,鏡檢。按公式計算吞噬百分率及吞噬指數,進行統(tǒng)計學處理。

1.2.3.5 自然殺傷細胞活性測定 連續(xù)灌胃25 d后,頸椎脫臼處死動物,取出脾臟,撕碎,過200目篩網后,用漢克平衡鹽溶液洗3次,用完全1640培養(yǎng)液配成5×106個/mL細胞懸液。將各只鼠的細胞懸液取300 μL分置于96孔培養(yǎng)板中,每孔加靶細胞(YAC-1細胞,1×105個/mL)100 μL,同時做靶細胞自然釋放孔(靶細胞100 μL+培養(yǎng)液100 μL)及最大釋放孔(靶細胞100 μL+1% NP-40 100 μL)各3孔,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h,取出1 500 r/min,離心半徑16 cm,離心5 min。將各孔上清液100 μL置于另一培養(yǎng)板中,每孔再加入100 μL基質液,10 min后加入1 mol/L HCl 30 μL終止反應,在490 nm處測定吸光度值,按公式計算自然殺傷細胞活性,并進行統(tǒng)計學處理。

1.2.4 耐缺氧功能實驗方法

1.2.4.1 常壓耐缺氧實驗 小鼠按體質量隨機分為5 mL/kg組、10 mL/kg組、15 mL/kg組(相當于人體推薦食用量的10、20、30倍)及對照組。各劑量組每日經口灌胃相應濃度的三勒漿,對照組灌胃等量蒸餾水,連續(xù)30 d。末次灌胃后1 h,將各組小鼠分別放入盛有15 g鈉石灰的250 mL磨口廣口瓶內(每瓶1只),用涂有適量凡士林的瓶塞蓋緊瓶口,立即計時,以呼吸停止為指標,觀察記錄小鼠因缺氧而死亡的時間。

1.2.4.2 急性腦缺血性缺氧實驗 小鼠按體質量隨機分為上述4組。各劑量小鼠每日經口灌胃相應濃度的三勒漿,對照組灌胃等量蒸餾水,連續(xù)30 d。末次灌胃后1 h,各組小鼠在乙醚淺麻醉的情況下自頸部逐只斷頭,立即計時,觀察記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時間。

1.2.4.3 亞硝酸鈉中毒存活實驗 小鼠按體質量隨機分為上述4組。各劑量小鼠每日經口灌胃相應濃度的三勒漿,對照組灌胃等量蒸餾水,連續(xù)30 d。末次灌胃后1 h,各組小鼠均腹腔注射亞硝酸鈉220 mg/kg立即計時,觀察記錄小鼠死亡的時間。

2 結果

2.1 安全性實驗結果

2.1.1 口服急性毒性實驗結果 在整個觀察期內,無論小鼠或大鼠,各三勒漿組均無動物死亡,三勒漿對小鼠和大鼠的經口半數致死劑量均大于21.5 mL/kg。

2.1.2 30 d喂養(yǎng)實驗結果 經過30 d喂養(yǎng)實驗后,各組動物平均增重和食物利用率測定測定結果:三勒漿給藥各組平均增重和食物利用率與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。血液學指標白細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白和血小板含量三勒漿給藥各組與對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。血糖、膽固醇、三酰甘油和肝腎功能實驗等所檢測的10項血清生化指標，三勒漿給藥各組測定值與對照組間差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。臟器系數結果：與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。大體解剖結果,三勒漿給藥各組動物未見異常。對心、肝、腎、胃、腸等器官的組織病理學鏡檢,三勒漿給藥各組也未見任何具有病理學意義的改變。見表4。

表1 三勒漿灌胃30 d對大鼠平均增重和食物利用率的影響

表2 三勒漿灌胃30 d對大鼠血液學指標的影響

表3 三勒漿灌胃30 d對大鼠血清生化指標的影響

表4 三勒漿灌胃30 d對大鼠臟器系數的影響

2.1.3 Ames實驗結果 無論加與不加S9混合液的實驗,陽性對照組皿的平均回變菌落數(+S9,TA102除外)均大于陰性對照組(劑量0)的2倍;而實驗樣品各劑量組的平均回變菌落數與陰性對照組相近。見表5。

表5 三勒漿每皿回變菌落數個/皿)

2.1.4 小鼠骨髓細胞微核實驗結果 小鼠骨髓細胞微核實驗結果。陽性對照組的平均微核出現率明顯高于陰性對照組(P<0.01),三勒漿各劑量組的微核率與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義。見表6。

表6 三勒漿小鼠微核實驗結果

2.1.5 小鼠精子畸形實驗結果 小鼠精子畸形實驗結果：陽性對照組的平均精子畸形率明顯高于陰性對照組(P<0.01),而三勒漿各劑量組與陰性對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 三勒漿精子畸形實驗結果(n=5)

2.2 抗疲勞作用結果 負重游泳實驗、血清尿素氮、肝糖原與血乳酸含量實驗結果：對照組小鼠的平均游泳時間僅為(6.70±2.26)min,灌胃三勒漿30 d后,各劑量組均能顯著延長小鼠的負重游泳時間(P<0.01),且三勒漿10.0 mL/kg組效果最優(yōu),平均負重游泳時間接近0.5 h,約為對照組的5倍。血清生化指標表明,服用三勒漿后,各劑量給藥組小鼠血清尿素氮含量顯著低于對照組,肝糖原含量明顯高于對照組,血乳酸含量顯著低于對照組。見表8。

表8 三勒漿對抗疲勞實驗結果

2.3 免疫調節(jié)作用結果 三勒漿對小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應的影響結果、對小鼠血清溶血素的影響結果、對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響結果、對小鼠自然殺傷細胞活性的影響結果：在小鼠遲發(fā)變態(tài)反應實驗中,與對照組比較,三勒漿10.0 mL/kg組和三勒漿15.0 mL/kg組小鼠的足趾腫脹度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在血清溶血素實驗中,各劑量組與對照組比較,其抗體積數差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。在小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗中,三勒漿10.0 mL/kg組和三勒漿15.0 mL/kg組與對照組比較,其吞噬百分率及吞噬指數差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在自然殺傷細胞活性實驗中,各劑量組與對照組比較,其自然殺傷細胞活性差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表9。

表9 三勒漿對小鼠免疫調節(jié)的影響

2.4 耐缺氧作用結果 三勒漿對小鼠常壓耐缺氧時間的影響:給予小鼠三勒漿30 d后,各三勒漿劑量組小鼠的常壓耐缺氧時間均有增加趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義。但三勒漿對小鼠急性腦缺血性缺氧時間有明顯影響,3個劑量小鼠的急性腦缺血性缺氧時間與對照組比較均有顯著延長(P<0.05或P<0.01)。見表10。三勒漿對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間的影響結果:給予三勒漿30 d后,三勒漿10.0 mL/kg組、三勒漿15.0 mL/kg組小鼠的亞硝酸鈉中毒存活時間與對照組比較顯著延長(P<0.05或P<0.01)。見表11。

表10 三勒漿對小鼠耐缺氧時間的影響

表11 三勒漿對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間的影響

3 討論

按照評價依據：三勒漿對小鼠和大鼠的經口半數致死劑量都大于21.5 mL/kg,急性毒性屬實際無毒(級);大鼠30 d喂養(yǎng)實驗的無作用劑量大于10.0 mL/kg；3項遺傳毒性實驗均為陰性結果；三勒漿具有明顯的抗疲勞作用、具有免疫調節(jié)和耐缺氧作用[9-10]。

本研究證實了三勒漿具有很好的安全性和確切的抗疲勞、免疫調節(jié)和耐缺氧作用,這也為傳統(tǒng)經典名方三果湯散(Triphala)的現代開發(fā)以及中藥保健食品走向世界提供了科學依據[15]。基于本實驗研究當時是依據首次頒布的保健食品毒理學及功能學評價程序，經過20余年的科技進步，保健食品注冊法規(guī)體系不斷完善和修訂[16-18]。三勒漿歷經30余年的市場檢驗，受眾易疲勞者、免疫力低下者及處于缺氧環(huán)境者，獲得良好口碑。但目前我們對疲勞的分類、疲勞與抗疲勞的機制處于探索階段，近期研究從細胞能量代謝的角度來建立疲勞的細胞模型，以解決快速篩選疲勞組分的方法，為抗疲勞功能保健食品研發(fā)提供新思路[19-20]。鑒于三勒漿中植物成分的復雜性，特別富含多酚類成分，具有廣泛活性的特點，尚需深入研究其特征活性成分與疲勞的相關性，為抗疲勞作用提供理論支撐。